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中药DNA条形码鉴定中的DNA提取方法研究
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中药DNA条形码鉴定中的DNA提取方法研究
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对一些DNA提取方法的总节（欢迎大家补充讨论）
有时候提DNA不是很顺，所以提出来大家讨论一下，因为我是做微生物的，我首先提供一下关于微生物的DNA 提取方法，大家觉的有可以改进的地方，欢迎讨论！！
细菌DNA的提取：
1. 抽提缓冲液
2% CTAB (W/V)
2% PVP K25 (w/v) （去色素）
100mM Tris-HCl (pH8.0)
25mM EDTA (pH8.0)
2.10M LiCl
3. 2M LiCl
4.DEPC-water（抑制RNA酶活性）
5. 3M NaAc (pH5.2)
6. 96% 乙醇
7. 70% 乙醇
1.抽提缓冲液65℃预热；
2. 加菌体到已经预热的缓冲液（700ul）中混匀，65℃，10min；
3. 加酚/氯仿/异戊醇（25：24：1），振荡，离心12,000rpm，10min；
4.取上清，加氯仿/异戊醇（24：1）振荡，离心12,000rpm，10min；
5. 取上清，重复4步骤；
6. 加入1/10体积的3M醋酸钠和1.5倍体积的乙醇（或加入等体积的异丙醇），－20C沉淀；
11. 离心12,000rpm，10min；
12. 弃上清，70％乙醇洗，也可以再用100％乙醇洗，然后溶解于100ml 水中。
(二)（我们常用的方法，但是有时有些细菌特别不好提，就用上面的方法）
1. 将菌株接种于液体LB培养基，37℃震荡培养过夜。
2. 取1.5ml培养物12000rpm离心2min。
3. 沉淀物加入567 ul的TE缓冲液，反复吹打使之重新悬浮，加入30ul 10%SDS和15ul的蛋白酶K，混匀，于37℃温育1h.
4. 加入100ul 5mol/L NaCl, 充分混匀，再加入80ul CTAB/NaCl溶液，混匀后再65℃温育10min。
5. 加入等体积的酚/氯仿/异戊醇混匀，离心4-5min, 将上清转入一只新管中，加入0.6-0.8倍体积的异丙醇，轻轻混合直到DNA沉淀下来，沉淀可稍加离心。
6. 沉淀用1ml的70%乙醇洗涤后，离心弃乙醇．
真菌DNA的提取：
1.取真菌菌丝0.5g, 在液氮中迅速研磨成粉
2.加入4mL提取液，快速振荡混匀
3.加入等体积的4mL的氯仿:异戊醇(24:1)，涡旋3～5min（此处是粗提没有加酚，可以节约成本的哟！）
4.1000rpm，4℃，5min
5.上清用体积的氯仿:异戊醇(24:1)再抽提一次（10,000 rpm，4℃离心5 min）
6.取上清，加入2/3倍体积的-20℃预冷异丙醇或2.5倍体积的无水乙醇沉淀, 混匀, 静置约30 min
7.用毛细玻棒挑出絮状沉淀, 用75%乙醇反复漂洗数次, 再用无水乙醇漂洗1次, 吹干，重悬于500 ulTE中
8.加入1 ul RNaseA （10 mg/mL），37℃处理1 hr
9.用酚（pH8.0）:氯仿:异戊醇(25:24:1)和氯仿:异戊醇(24:1)各抽提1次（10,000 rpm，4℃离心5 min）
10.取上清，1/10V 3M NaAc,2.5V体积的无水乙醇, -70℃沉淀30 min以上
11.沉淀用75%乙醇漂洗，风干, 溶于200 ulTE中，-20 ℃保存备用
DNA提取液：0.2M Tris-HCl（pH 7.5），0.5M NaCl，0.01M EDTA，1％SDS，
1.真菌菌丝0.5-1 g, 在液氮中迅速研磨成粉
2.加入3 mL 65℃预热的DNA提取缓冲液，快速振荡混匀65℃水浴30 min, 期间混匀2-3次
3．加入1 mL 5M KAc，冰浴20 min
4．等体积的氯仿:异戊醇(24:1)抽提1次（10,000 rpm，4℃离心5 min）
5．取上清，加入2/3倍体积的-20℃预冷异丙醇, 混匀, 静置约30 min
6．用毛细玻棒挑出絮状沉淀, 用75%乙醇反复漂洗数次, 再用无水乙醇漂洗1次, 吹干，重悬于500 L TE中
7．加入1 ul RNaseA （10 mg/mL），37℃处理1 hr
8．用酚（pH8.0）:氯仿:异戊醇(25:24:1)和氯仿:异戊醇(24:1)各抽提1次（10,000 rpm，4℃离心5 min）
9．取上清，1/10V 3M NaAc,2.5V体积的无水乙醇, -70℃沉淀30 min以上
10．沉淀用75%乙醇漂洗，风干, 溶于200 ul TE中，-20 ℃保存备用。
以上是我们常用的方法．
据说还有特别简便的一种PCR模板的制作方法，有知道的小虫能说出来分享．
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标题: 不要总是说PVP30~40会心没意义没意义的
作者: 骑士之毁灭狼牙& & 时间:
标题: 不要总是说PVP30~40会心没意义没意义的本来也没去注意，今天早上黑龙威望的时候点了个和尚轰了好一阵
基本上3四象里会有一次会心，虽然伤害不高，会心后才6000多的四象，没锁足
我会心是36.5%，准备提升到40%左右
说实在点，附满御劲的人并不算太多
我看着连出会心以为和尚穿的大都是副本套，点开他看了下
230威望武器+4件255+2件230，首饰4件+暗器全是230威望
也没去问对方多少御劲，不过按装备算的话，25%~~28%左右是肯定有的
老是看别人说会心在40左右没意义，出不了什么会心，但是实际打人的时候并非如此啊
晚点再找几个***255的试一下出会心的情况
作为CY，会心肯定要有的，但是有个底线也好一点
无聊特此水一水，好饿
作者: HeatherLuck& & 时间:
晚饭吃的好饱……
作者: 柳月狐& & 时间:
至少我的会心套能保证在控制下爆发招招会心。。。
作者: 骑士之毁灭狼牙& & 时间:
晚饭吃的好饱……
HeatherLuck 发表于
吃的什么菜，说说让我口水一下
作者: 骑士之毁灭狼牙& & 时间:
至少我的会心套能保证在控制下爆发招招会心。。。
柳月狐 发表于
招招会心，全会心套也不敢保证吧
我说这个没别的意思，只是想说一下不是全会心套并没有那么悲剧而已~
其实会心破防无非是个人喜欢而已
选装备的时候没必要那么小心谨慎嘛
作者: 柳月狐& & 时间:
破防装只能让输出变得平稳没有爆发力，副本破防确实重要，但是PK真的不必要，气纯这条路线直接全会心会伤内功就行了，原来我还打算保持300+破防的，打木桩数值确实高，但是打人稀烂啊。
作者: 骑士之毁灭狼牙& & 时间:
本帖最后由 骑士之毁灭狼牙 于
19:00 编辑
破防装只能让输出变得平稳没有爆发力，副本破防确实重要，但是PK真的不必要，气纯这条路线直接全会心会伤内功就行了，原来我还打算保持300+破防的，打木桩数值确实高，但是打人稀烂啊。 ...
柳月狐 发表于
但是会心套没控住人输出也并不高啊
其实破防没必要特意去保持啊，有个好的五彩的话，178+经脉50，就已经200多破了~
而且破防如果没有对方内防高的话，会出现减伤的
这个刚到80不久我就试过了，减伤几率还挺高的
现在如果经脉点了内防加装备什么的，算上秀气和般若，一般内防都能在350左右
至少得保证破防高于对方内防才OK啊
作者: HeatherLuck& & 时间:
本帖最后由 HeatherLuck 于
19:05 编辑
骑士之毁灭狼牙 发表于
莲藕 甘蓝 白粥
作者: 骑士之毁灭狼牙& & 时间:
莲藕 甘蓝 白粥
HeatherLuck 发表于
。。。。。说实话好久没喝粥了。。。现在想想真的挺流口水的。。。
作者: HeatherLuck& & 时间:
。。。。。说实话好久没喝粥了。。。现在想想真的挺流口水的。。。
骑士之毁灭狼牙 发表于
锅里还有一碗半，空投要么
作者: 柳月狐& & 时间:
但是会心套没控住人输出也并不高啊
其实破防没必要特意去保持啊，有个好的五彩的话，178+经脉50，就已经200多破了~
而且破防如果没有对方内防高的话，会出现减伤的
这个刚到80不久我就试过了，减伤几率还挺高的 ...
骑士之毁灭狼牙 发表于
没控住人神一样的气纯也打不出伤害啊。你真的确定现在还有减伤机率么？反正我是没碰到过。。。
作者: 骑士之毁灭狼牙& & 时间:
没控住人神一样的气纯也打不出伤害啊。你真的确定现在还有减伤机率么？反正我是没碰到过。。。
柳月狐 发表于
恩,这个我在开了230之后也双开号测试过的,确实会出现减伤的情况,我之前发过贴不过忘了什么名字了~
晚点不卡我再试试
作者: Mascara须须& & 时间:
我不是很早就40会心了么。。
你们不信我的~~没办法
作者: 孤寂浪天涯& & 时间:
但是会心套没控住人输出也并不高啊
其实破防没必要特意去保持啊，有个好的五彩的话，178+经脉50，就已经200多破了~
而且破防如果没有对方内防高的话，会出现减伤的
这个刚到80不久我就试过了，减伤几率还挺高的 ...
骑士之毁灭狼牙 发表于
这个确实作为会心套的前提条件之一
一般破防300就可以
五彩178+经脉50+破防武器=300
作者: 任子轩& & 时间:
我想问一下，1：***威望装命中太低，命中附魔到哪个部位好呢？2：还有就是七星和捉影的取舍，总觉得七星很鸡肋。3：是韬光和临风的取舍。纠结啊。找不到人解答
作者: 骑士之毁灭狼牙& & 时间:
命中看你缺多少吧
头部好象是53吧
衣服裤子是70
好象31.7就是1%吧
作者: 孤寂浪天涯& & 时间:
腰带45或42
帽子55或53
作者: 任子轩& & 时间:
天拉，我命中94%多，不可能***都付命中吧？
作者: 孤寂浪天涯& & 时间:
护手，帽子，下装附魔就够100了
作者: 任子轩& & 时间:
那镇派呢，捉影和七星的取舍，韬光回豆和生阳的取舍
作者: 流星蝴蝶?剑& & 时间:
头手裤子,正好命中100.05%,一点都没浪费.
作者: 流星蝴蝶?剑& & 时间:
喜欢打群架的用会心装秒人，点临风捉影八荒，锅现在把混元伤害都改成血红色了，杀人刺激，喜欢单挑的用破防磨人，可以点临风也可以点生阳，七星必点。
作者: 流星蝴蝶?剑& & 时间:
楼主没必要跟纯会心装的气纯争论，锅也是纯会心会伤，包括石头，群P混战取人头爽到一逼，但是单挑就比较逊色了，少了七星的套路，血抗也低，往往不能撑到爆发的时机出现，不过这并不影响会心装在野战中的疯狂杀戮。
作者: 叶落雨& & 时间:
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作者: 水蓝色的旋律& & 时间:
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作者: 凌羽落& & 时间:
事实就是这样
作者: 三星某某& & 时间:
会心有个三十几，就去堆堆破防攻击
作者: 闲云飞1& & 时间:
那是你看着的4象会心6000 ，，有郊伤害有可能是2000
作者: 南宫白衣& & 时间:
剑纯，命中100.17会心50会伤234破防400攻击6600
作者: 我思我念& & 时间:
难道上我上图吗？我就40多会心了！
作者: ?　笑。& & 时间:
破防377,LZ打HS不定身有6000表示很怀疑.我打HS会心就5000+左右.
作者: 长恨殇& & 时间:
这个不好说得。。纯会心~
作者: 皎弟& & 时间:
求指教，13阶纯会心套，项链、腰坠是破防，会心44多点，手和腰带FM命中，头、衣、裤FM破防，攻击才9300多点，破防接近300，命中97，打架叫个悲剧，现在应该怎么选择,比如FM 还有攻击低的太离谱了吧???
作者: Aze& & 时间:
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作者: 骑士之毁灭狼牙& & 时间:
本帖最后由 骑士之毁灭狼牙 于
13:52 编辑
/hu/attachment//f.jpg破防377,LZ打HS不定身有6000表示很怀疑.我打HS会心就5000+左右.
?　笑。 发表于
怀疑吧，没事，我是懒得去弄图了，爱信不信哈
另外说一下，我破防400出头，攻击比你高1300
我本来只是想说40左右会心对于大部分威望套的人已经足够，没必要太夸张，怎么被你一说我成了来炫伤害似的
作者: 水蓝色的旋律& & 时间:
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作者: fergwgwege& & 时间:
人品一出天下无敌，话说当初点奇穴有人连通7个的又能说明什么呢。
作者: JS你还能做游戏么& & 时间:
看好对方没解控时候&& 大道定6秒 果断开 回豆 开外丘 甩无我甩天地 接 剑冲 接 人剑 甩无我 接悬钟 甩天地甩无我 甩无我 轰死他们
作者: 孤寂浪天涯& & 时间:
全身装备齐了
极品五彩石打了
每天呆在黑龙
欢迎光临 剑侠情缘网络版叁 (http://jx3./)
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