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哺乳动物体外受精的过程。(1)精子采集的方法主要有_________、_________和_______。获能的方法有__________和____________。(2)体外受精的过程主要包括___________、___________及受精等几个步骤。(3)怎样用一个流程图表示体外受精的过程？
题型：填空题难度：中档来源：同步题
(1)假***法&& &手握法&&& 电刺激法&&& 培养法&&& 化学诱导法(2)卵母细胞的采集和培养&&& 精子的采集和获能(3)
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体外受精和早期胚胎培养
体外受精与胚胎的早期培养：1、体外受精的原理：人工模拟体内环境（包括营养、温度、pH等），使初级卵母细胞成熟和精子获能，最终完成受精和胚胎保存。2、体外受精主要操作步骤（1）卵母细胞的采集和培养：方法一：对小型动物一般用促性腺激素处理，使其排出更多的卵子，然后，从输卵管中冲取卵子，直接与获能的精子在体外受精。方法二：对大型动物是借助超声波探测仪、腹腔镜等直接从活体动物的卵巢中吸取卵母细胞，在体外经人工培养成熟后，才能与获能的精子受精（或从刚屠宰母畜的卵巢中采集卵母细胞）（2） 精子的采集和获能：在体外受精前，要对精子进行获能处理。采集方法：假***法、手握法和电刺激法等。获能方法：培养法和化学法。（3） 受精：获能的精子和培养成熟的卵细胞在获能溶液或专用的受精溶液中完成受精过程。3、胚胎的早期培养：（1）培养目的：精子与卵子在体外受精后，应将受精卵移入发育培养液中继续培养，以检查受精状况和受精卵的发育能力。（2）培养液成分：除一些无机盐和有机盐外，还需添加维生素、激素、氨基酸、核苷酸等营养成分，以及血清等物质。（3）当胚胎发育到适宜的阶段时，可将其取出向受体移植或冷冻保存。不同动物胚胎移植的时间不同。（牛、羊一般要培育到桑椹胚或囊胚阶段才能进行移植，小鼠、家兔等实验动物可在更早的阶段移植，人的体外受精胚胎可在4个细胞阶段移植）。知识拓展：1、早期胚胎是指可用于移植的胚胎，在原肠胚之前的囊胚、桑椹胚甚至更早的阶段。2、受精后形成的受精卵需经早期发育培养，才能完成植入或着床。3、胚胎早期培养液成分与动物细胞培养液成分基本相同，除无机盐、营养成分和调节物质外，还需要血清、抗生素等，两者都是液体培养基，但植物组织培养为固体培养基，其中加入琼脂，所需植物激素主要是生长素和细胞分裂素两大类。
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辅助生殖技术中优选精子的精液处理
作者：盛连兵，尹 璐，刘海萍，王海玉　&&&&作者单位：250031 山东济南，济南军区总医院生殖医学中心
【关键词】& 辅助生殖技术;优选精子;精液;处理方法
　　辅助生殖技术(assisted reproductive technique，ART)就是利用医学手段辅助不孕症夫妇获得妊娠。目前，应用于临床的辅助生殖技术有人工授精(artificial insemination，AI)和体外受精-胚胎移植(Invitro fertilization and embryo transfer，IVF-ET)及在传统体外受精技术基础上发展起来的卵胞浆内单精子注射(intracy-toplasmic sperm injection，ICSI)等。无论哪一种辅助生殖技术，都需要对精液进行实验室处理，优选成熟的、具有受精潜能的活动精子。精子在体外环境中处理，会承受许多不良刺激，生理、生化及功能会发生变化，如何减少体外处理过程对精子的不良刺激，保证处理后回收足量具有正常形态和功能的精子，是体外精液处理过程中需要注意的问题。本文将常用的体外精液处理方法进行简单介绍，并对精液处理过程需要注意的问题进行探讨。
　　1 精液处理方法
　　精液的处理过程包括精液液化和精子优选。
　　1.1 精液液化
　　刚射出的新鲜精液呈一种稠厚凝固状，精液的液化大约需要5～25min，如超过30min仍不液化称为精液不液化症[1]，提示精浆成分异常，常因附属腺病变引起前列腺液与精囊液比例失调或成分发生变化所致，异常的精浆对精子是不良的生存环境，故在排出精液后应尽快促进精液液化，继而使精子与精浆分离。常用的促进精液液化的方法是在每ml精液中加糜蛋白酶4000IU或将精液反复通过18号或19号针头加压推出[2]。如效果不好，可用培养液与精液1：1稀释后用吸管反复吹打，直至液化。
　　1.2 精子优选处理方法
　　1.2.1 上游法(swim-up)
　　是一种常用的精液处理技术，主要用于精液质量较好和&相对正常&的精液，利用活动精子的游动能力，即能游过液体界面进入不同的培养液，从而自行与死精子、凝集精子、白细胞及杂质分离。根据上游前有无离心操作分为直接上游法和离心上游法。
　　直接上游法：将含10%的血替代物(SPS，SageBiopharma)的拟人输卵管液(mHTF)2ml加入圆底试管，在试管底缓慢加入液化精液1ml，精液量较多时可多用几支试管，使两层之间形成界面，将试管倾斜45&，置于37℃、5% CO2培养箱内孵育40～60min，取出试管，吸出上清液的中上层呈云雾状的液体，移入离心管，离心200g&6min，弃上清液，取精子团加上述培养液0.5ml制成精子悬液备用[3]。
　　离心上游法：即改良上游法，将液化精液与新鲜培养液1：1混匀后，移入离心管，离心200g&5min，弃上清液，取沉淀按上述方法上游处理。
　　上游法是目前推荐的方法，因为在整个处理过程中除了培养液，不含其他的化学物质[4]。其不足是运动精子回收率低，回收率依赖于精子细胞团表面积和精子活动力，由于细胞团有多层细胞，有潜在运动能力的精子可能处在细胞团内部，不能达到与培养基接触的界面。为提高回收率，可采用少量多管直接上游，以增加精液与培养基的总界面。Al-Hasani等[4]建议采用每管精液和培养基(1：1～3)总量<1ml的微型上游技术(mini-swim-up)，仔细移出75%～80%的上层培养基，即可增加正常活动精子数量，又不增加精子DNA的损伤，可用于优选处理较严重的少弱畸精子，用于ICSI。
　　1.2.2 梯度离心法(density gradient centrifugation)
　　适用于大多数的精液样本，对粘度大及明确有抗精子抗体的精液样本尤为有效，并且该方法可同时有效去除碎片和白细胞[5]。分为连续梯度离心法和不连续梯度离心法。
　　连续梯度离心法：取90%密度梯度液1ml置于离心管底部，然后将液化的精液1.5～2ml加在其上。注意保持二者界面的清晰，当精液量大于2ml时，可多用几支离心管。离心300g&15min，当精液黏稠度较高或精子密度较低时，可适当延长离心时间10～20min。去除离心管上部的精浆和密度梯度液，小心收集底部的精子沉渣，在离心管中加入3～5ml培养液，重新混悬精子，离心200g&6min，弃上清，根据需要调整授精液体积，并重新混悬置培养箱备用。不连续梯度离心法：取2ml 80%密度梯度液加入到一支离心管底部，再沿管壁缓慢加入2ml 40%密度梯度液，保持两液体之间有清晰的界面。在两液体上面缓慢加入已液化的精液1.5ml，保持与40%密度梯度液之间的界面清楚。离心300g&15min，当精液黏稠度较高或精子密度较低时，可适当延长离心时间10～20min。去除离心管上部的精浆和密度梯度液，小心收集底部的精子沉渣，将其移入一新离心管中，加入10ml培养液，重新混悬精子，离心200g&6min，弃上清，根据需要调整授精液体积，重新混悬精子沉渣，置培养箱备用。
　　密度梯度法处理后的精子，与直接采集的精子[6]以及上游法处理得到的标本[7]相比，其畸形精子的比例明显降低。Sakkas等[8]报道，密度梯度离心法可分离出DNA断裂的和染色体浓缩差的精子。Erel等[9]认为，异常精子经密度梯度离心法处理后，得到精子的顶体反应率、低渗肿胀实验阳性率和核成熟的精子比例均优于上游法。
　　1.3 玻璃纤维过滤法
　　玻璃纤维具有滤过作用，精液以一定的速率通过时，可以清除精液中的不活动的精子、其他细胞及杂质,特别是对黏滞性较大的标本，可除去大量的凝集精子，增加精子的活动率。该方法是将一定数量的玻璃纤维填入一长约12cm的Pasteur吸管，用培养液反复冲洗滤过，直到滤过液中无玻璃纤维碎屑存在。将Pasteur吸管垂直固定与试管架上，将液化的精液加在玻璃纤维柱的顶端，在其下用一个无菌的玻璃容器收集滤出的精液。收集的精液中虽然损失相当多的精子，但滤过的标本几乎保留了所有的活动精子，可以显著提高活动精子及有完整功能性细胞膜精子的百分率，对精子质量差的精液分离效果更佳,可除去大约90%的白细胞。此外，该法还明显提高精子染色体的完整性，可作为ICSI精子处理的首选方法[7]。精液处理效果与选用的玻璃纤维种类、规格和过滤时冲洗的强度等直接相关。
　　1.4 血清白蛋白过滤法
　　利用不同浓度血清白蛋白对精子产生滤过作用的原理来分离优选精子。方法是在试管底部放置20%白蛋白液,上方放置10%白蛋白液，使两层液面之间形成界面。将经离心洗涤的精子悬液覆盖在10%白蛋白液上方。在室温下孵育一定时间后，将20%白蛋白液离心，收集其中的活动精子，用培养液稀释后备用。
　　2 精液在体外处理过程中需要注意的问题
　　2.1 离心对精子的损伤
　　离心是精液处理中常使用的步骤之一，不可否认，离心对精子有一定的损害。Aitken报道，将精子离心可使活性氧类物质(reactive oxygen species，ROS)急剧增高，人类精子膜含有大量不饱和脂肪酸，易于在活性氧作用下发生过氧化，导致细胞膜流动性降低或丧失。有缺陷的精子是ROS的主要来源，由异常精子产生的高浓度ROS可使正常、异常精子细胞膜均受到损害。若先将液化后的精液进行上游，然后再将上游到培养液中的活动精子进行离心，可大大减少ROS的产生，该种方法的受精效果已经有报道证实。Mortimer也认为对精液离心后再用上游法优选精子可能是导致受精失败的原因。
　　2.2 缩短精液收集至精液处理、精液处理至授精时间
　　精液体外处理过程中对精液进行洗涤时，去能因子被祛除，可使精子获能，获能的精子尤其是形态正常及活动力好的精子容易发生顶体反应。有文献报道，如将优选后的精子在培养液中孵育2.5h，呈快速直线前向运动的精子有25%自发发生顶体反应，而活动力较差的精子在孵育6h后仅有15%发生顶体反应[10]。Yavas等[11]研究在HMG促排卵人工授精时，延迟精液处理时间30～60min或延迟精液收集至人工授精90min～2h可降低妊娠率。取精至精液处理时间的延长，使精液中ROS对精子活力的损伤增加。精液处理至人工授精时间延长，可能与处理后精子运动使培养液中葡萄糖、果糖能源的耗竭，以至于在人工授精后，精子不能到达输卵管受精的场所，而影响受精的能力。因此，在实施辅助生殖技术时，注意不要过早采集精液，且在处理精液后及时进行人工授精或体外受精，尽量缩短精子在体外环境中的时间。
　　精液处理是辅助生殖技术中重要一步，其目的是优选成熟、活动并具有受精能力精子。精子优选的方法较多，各有优缺点，每个实验室应摸索适合自己的方案。随着生殖医学的发展，人们对精子的认识有了很大进步，但在许多方面还有待更深入的研究，相信随着对精子认识的深化以及生殖医学界同仁对精液体外处理方法的研究总结，精液体外处理技术将会不断完善，由此推动辅助生育技术进一步发展。
【参考文献】
& 　　1 马乐，潘柏年，陈宝英.男性不育与辅助生殖技术.北京：人民卫生出版社，.
　　2 王怀秀，李弘 . 辅助生殖技术中精液处理的重要性.中国男科学杂志，)：2-5 .
　　3 徐巧敏，夏舟岚，昊美君. 两种精液处理方法对官腔内人工授精妊娠率影响的比较.实用医学杂志,):456-457.
　　4 Al-Hasani S，Kfipker W ，Baschat AA，eta1.Mini-swim-up：a new technique of sperm preparation for intracytoplasmic sperm iniection.J Assist Reprod Genet，);428-433.
　　5 Peter R .Brinsden.体外受精与辅助生殖.北京：人民卫生出版社，2.
　　6 Tomlinson MJ,Moffatt O,Manicardi C,etal. Inter-relationships between seminal parameters and sperm nuclear DNA damage before and after density gradient centrifugation :implications for assisted conception .Hum Reprod，0-2165.
　　7 Hammadeh ME，Kuhnen A，Amer AS，parison of sperm preparation medthods:effect on chromatin and morphology recovery rates and their consequences on the clinincal outcome after in vitro fertilisation embryo transfer .Int J Androl，-368.
　　8 Sakkas D，Mnicardi GC，Tomlinson M ，eta1.The use of two density gradient centrifugation techniques and the swim-up method to separate spermatozoa with chromatin and nuclear DNA anomalies.Hum Reprod，)：.
　　9 Erel CT，Senturk LM，Irez T， et al.Sperm-preparation techniques for men with normal and abnormal semen analy-sis.A comparison.J Reprod Med，)：917-922.
　　10 黄平治，李永海.男性不育.北京：科学技术文献出版社，7.
　　11 巫新春. 缩短精液收集至精子洗涤、精子洗涤至官腔内人工授精(IUI)及精液收集至IUI时间增加IUI妊娠率. 国外医学?计划生育/生殖健康分册,):181-182.
　　(本文编辑：守 中)
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