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镉对大鼠前列腺损伤及锌保护的超微结构与硫胺素焦磷酸酶细胞化学的研究
解剖学报 2000年第4期第31卷 论著
作者：罗子国　李维信
单位：罗子国（重庆医科大学电镜室，生殖医学超微结构实验室，重庆，400016）；李维信（重庆医科大学电镜室，生殖医学超微结构实验室，重庆，400016）
关键词：前列腺；超微结构；硫胺素焦磷酸酶(TPPase)；镉；锌；大鼠
　　【摘要】　目的　研究镉对大鼠前列腺腹侧叶的超微结构影响及锌保护作用。　方法　小剂量氯化镉(2 mg/kg体重)及锌腹腔内注射后用透射电镜观察及硫胺素焦磷酸酶(TPPase)电镜细胞化学定量分析。　结果　镉注射后4 h，前列腺上皮主细胞出现轻微的超微结构改变，3～7 d呈明显退变，15 d退变减轻，出现粗面内质网(RER)形成的同心圆性小体，30～60 d基本恢复正常。镉注射后4 h，TPPase反应产物较正常组减少，3 d和15 d进一步减少。锌保护组较相应的单纯镉组的超微结构损伤轻，且TPPase反应产物也较多。　结论　镉对大鼠前列腺腹侧叶上皮主细胞早期直接损伤较轻，所致TPPase反应产物减少明显。锌对镉所致主细胞超微结构损伤及TPPase活性降低均有保护作用。研究镉对大鼠前列腺腹侧叶的超微结构影响及锌保护作用。　方法　小剂量氯化镉(2 mg/kg体重)及锌腹腔内注射后用透射电镜观察及硫胺素焦磷酸酶(TPPase)电镜细胞化学定量分析。　结果　镉注射后4 h，前列腺上皮主细胞出现轻微的超微结构改变，3～7 d呈明显退变，15 d退变减轻，出现粗面内质网(RER)形成的同心圆性小体，30～60 d基本恢复正常。镉注射后4 h，TPPase反应产物较正常组减少，3 d和15 d进一步减少。锌保护组较相应的单纯镉组的超微结构损伤轻，且TPPase反应产物也较多。　结论　镉对大鼠前列腺腹侧叶上皮主细胞早期直接损伤较轻，所致TPPase反应产物减少明显。锌对镉所致主细胞超微结构损伤及TPPase活性降低均有保护作用。
　　【中图分类号】　R994.6　【文献标识码】　A　【文章编号】　00)04-368
THE INJURIOUS EFFECTS OF CADMIUM AND PROTECTION
　　OF ZINC ON ULTRASTRUCTURE AND CYTOCHEMISTRY OF
　　TPPase OF PROSTATE IN RAT
LUO Zi-guo　LI Wei-xin
　　（Laboratory of Electron Microscopy, Chongqing University of Medical Sciences, Chongqing 400016, China）
　　【Abstract】　Objective
To study the ultrastructural effects of cadmium(Cd) and protection of zinc(Zn) on ventral prostate in rat.Methods The rats were intraperitoneally injected with CdCl2 (2 mg/kg body weight) and Cd+Zn. The specimens were investigated by transmission electron microscope and quantitative analysis of the changes of the cytochemical reactive product of TPPase.Results Mild ultrastructural alterations of principal cells of prostate were detected after 4 hours of Cd treatment. The changes became most prominent within 3-7 days, but tended to alleviate after 15 days. After 30-60 days, the cells had recovered almost to normal. TPPase reactive product of principal cells decreased 4 hours after Cd treatment and became further reduced after 3 and 15 days. The protective effects of Zn on Cd-induced injuries and TPPase reactivity of principal cells were pronounced.Conclusion The early directed injurious effects of Cd on the ultrastructure and TPPase activity in principal cells of ventral prostate in rat were milder. Zn had obvious protective effects on the injuries by cadmium.
　　【Key words】 V U TPP C Z Rat
　　前列腺是雄性生殖系统的重要附属性腺，其分泌物占精液成分的30%，同时可分泌多种活性物质。它的正常结构和功能依赖雄激素的作用，阉割大鼠后前列腺体积明显变小，上皮萎缩［1］。镉可致多***损害，半衰期很长，对人的生殖功能具有潜在的危害性［2］。镉在电池、电镀及半导体工业中应用广泛，对其毒害作用的研究受到了多学科的重视。我们曾报道小剂量氯化镉(2 mg/kg体重)可致大鼠睾丸、附睾、精囊腺和输精管出现超微结构的明显损伤，雄激素水平下降，锌对镉所致损伤有保护作用［3～6］。有关镉对前列腺的影响，文献报道多集中在通过饮水给药或注射后长期所致的慢性损伤。对正常人及前列腺增生和前列腺癌患者的前列腺组织与血浆中镉、锌浓度的关系也有报道［7～9］。但有关镉对前列腺早期损伤及锌保护作用尚未见报道。本研究通过超微结构观察及高尔基复合体标志酶TPPase电镜细胞化学定量分析，探讨小剂量氯化镉对大鼠前列腺腹侧叶上皮主细胞的影响和锌的保护作用及其机理。
材料和方法
　　1. 动物分组、取材及电镜样品制备
　　健康成年雄性Wistar大鼠51只，体重195～240 g，分单纯镉组、镉加锌组和对照组，其中单纯镉组32只，镉加锌组8只，对照组11只。单纯镉组按2 mg/kg体重剂量，一次腹腔内注射0.1%氯化镉(生理盐水配制)，分别于4 h、1、3、7、15、30及60 d取材。镉加锌组分3次注射，先注射1%醋酸锌15 mg/kg体重，2 h后注射氯化镉2 mg/kg体重和醋酸锌50 mg/kg体重，再间隔2 h注射醋酸锌15 mg/kg体重，醋酸锌总剂量为80 mg/kg体重，分别于3 d和15 d后取材，对照组腹腔内注射等体积的生理盐水。氯化镉、醋酸锌的注射剂量及方法参照Saksena［10］等的报道。
　　切取大鼠前列腺腹侧叶左叶小块组织，用磷酸盐缓冲液配制的4%戊二醛及1%四氧化锇作预固定和后固定(pH7.2～7.4)，酒精及丙酮逐级脱水，作半薄切片经1%次甲基蓝-天青Ⅱ染色后，光镜下定位腺泡，再制备超薄切片。用醋酸双氧铀及枸橼酸铅染色，H-600型透射电镜观察。
　　2. TPPase 电镜细胞化学样品制备
　　取单纯镉注射后4 h、3 d、15 d及镉加锌3 d、15 d和对照组共6组动物前列腺腹侧叶右叶小块组织，经提纯的2.5%戊二醛固定1 h，再制备厚约100μm的薄片，置入孵育液(主要含硫胺素焦磷酸、氯化锰、硝酸铅等)37℃孵育90 min。对照孵育液去底物硫胺素焦磷酸。孵育后用Tris-Maleate缓冲液漂洗30 min(pH7.2)，转入磷酸盐缓冲液(pH 7.2～7.4)，经1%四氧化锇后固定1 h，再转入常规电镜样品制备，但超薄切片不经枸橼酸铅染色。
　　3. 主细胞TPPase电镜细胞化学定量分析
　　透射电镜下恒定放大25 000倍，每组随机拍摄上皮不同主细胞核上区胞质高尔基复合体区10张，共60张照片。运用CM-2000生物医学图像分析系统对照片TPPase反应产物总面积与背景面积之比(TA/BA)进行测量。所有测量数据均以平均值±标准差(±s)表示，采用方差分析，并作多组比较。SPSS 8.0软件运算，微机自动处理结果。
　　1. 大鼠前列腺腹侧叶正常超微结构
　　正常大鼠前列腺腹侧叶上皮属假复层柱状上皮，由主细胞和基细胞组成。主细胞胞质在电镜下可分为顶区、高尔基区、核周区和基底区。顶部微绒毛(MV)长短不等，部分主细胞顶区可见含有中等或低电子密度的分泌颗粒及有衣小泡。高尔基区具有多个高尔基复合体，高尔基复合体含有典型的扁平囊泡、运输小泡及不同电子密度的分泌泡。高尔基区胞质内，还具有少量多泡小体及一些溶酶体。核周区含有大量平行排列的粗面内质网(RER)，其腔内含有低电子密度的絮状物质。基底部有散在的RER和线粒体。核位于细胞的基底部，呈圆形或椭圆形，异染色质较少，核仁明显(图1)。
　　2. 镉对前列腺腹侧叶主细胞损伤的超微结构改变
　　镉注射后4 h即见大部分主细胞的部分线粒体有内室肿胀，其中一些线粒体还有髓样结构改变。此外，在部分主细胞侧壁质膜也见有髓样结构，但RER基本正常(图2)。镉注射24 h后，主细胞的上述改变加重，表现为有较多线粒体内室肿胀，髓样结构数量增多，且见部分主细胞的高尔基复合体扁平囊泡明显扩大，排列紊乱。3～7 d阶段，上皮主细胞线粒体广泛肿胀伴空泡化，高尔基复合体扁平囊泡的扩张更加严重，甚至有少数主细胞高尔基复合体的扁平囊泡膜破裂，融合成多个不规则的大空泡。部分主细胞核异染色质边集，但RER基本正常(图3)。15 d组，大多数主细胞的高尔基复合体扁平囊泡仅有轻度扩张，但其腔内充满低电子密度的絮状物质，而分泌颗粒极少见，提示其排泌功能受阻。溶酶体数量普遍增多，微绒毛稀少且短(图4)。30 d组，高尔基复合体数量较少，但形态基本正常，溶酶体数量更加增多，且部分主细胞内RER形成同心圆小体及出现池内封隔(图5)。镉注射后60 d，上皮大部分主细胞超微结构基本恢复正常，少数主细胞线粒体仍有轻度肿胀及有较多髓样结构，RER及分泌颗粒也较正常明显减少。
　　3. 锌对镉所致大鼠前列腺腹侧叶上皮主细胞损伤的保护
　　镉锌联合注射后3 d，上皮主细胞退变较单纯镉组轻，仅见部分线粒体内室肿胀及少量的髓样结构，高尔基复合体扁平囊泡轻度扩张，RER无明显改变(图6)。镉锌联合注射后15 d，与相应单纯镉组比较，其保护作用最为明显。表现为线粒体和高尔基复合体形态普遍基本正常，仍有部分RER腔扩张，腔内有大量低电子密度的物质蓄积，溶酶体也较单纯镉组少。细胞表面微绒毛减少，可见一些分泌颗粒(图7)。
　　4. 前列腺腹侧叶主细胞TPPase酶学图像分析结果
　　正常大鼠前列腺腹侧叶上皮主细胞高尔基复合体发达，TPPase反应产物呈高电子密度颗粒状，分布于高尔基复合体成熟面的扁平囊泡，其数量较多(图8)。在其他细胞器及胞质中呈阴性。
　　镉注射后4 h，高尔基复合体扁平囊泡内TPPase反应产物分布较松散且颗粒较大，数量减少。3 d和15 d组TPPase反应产物颗粒小而分散，数量进一步减少(图9，10)。锌保护3 d组TPPase反应产物数量与相应单纯镉组无明显差别(图11)，而锌保护15 d组TPPase反应产物则较相应单纯镉组有明显增多(图12)。
　　图像分析结果经统计学处理表明，镉注射后4 h及3、15 d酶反应产物与背景面积之比(TA/BA)与对照组比较有显著差异(P＜0.05)，3组之间均有显著性差异(P＜0.05)，且呈递减趋势。锌保护3 d组与对照组(TA/BA)之间有显著性差异(P＜0.05)，与单纯镉3 d组之间无显著性差异(TA/BA)，而锌保护15 d组与对照组(TA/BA)之间无显著性差异(P＞0.05)，与单纯镉15 d组(TA/BA)比则有显著性差异(P＜0.05)。结果见附表。
附表　硫胺素焦磷酸酶(TPPase)超微酶学定量分析TA/BA(±s)
　　Table　 Image analysis of ultrastructural localization of TPPase reactive product TA/BA(±s)
给药后时间(time of treatment)
组别(group)
4小时(4 h)
0.01 082±0.0 008 207a,b
0.0 070±0.0 008 470a,c,d
0.005 059±0.0 006 067a,b,c
镉+锌(Cd+Zn)
0.007 646±0.001 030a,c,d
0.01 782±0.002 480b,c,d
对照(control)
0.01 846±0.002 280
　　注：a.与对照组比较P＜0.05；b.与单纯镉3d组及Cd+Zn3d组比较P＜0.05；c.与单纯镉4 h比较P＜0.05；d.与单纯镉15d组比较P＜0.5；Notes:a,compared with control, P＜0.05; b,compared with 3d after Cd and 3d after Cd+Zn,P＜0.05; c,compared with 4 h after Cd; P＜0.05; d,compared with 15d after Cd讨　　论
　　大鼠前列腺腹侧叶上皮主细胞呈高柱状，具有旺盛的合成及分泌蛋白质的超微结构基础，表现为主细胞内有丰富的RER和发达的高尔基复合体。本研究重点观察了镉对大鼠前列腺这些结构的超微结构损伤和定位于高尔基复合体的TPPase活性影响，以及锌的保护作用。Fowler［2］等报道，小剂量CdCl2(2mg/kg体重)腹腔内注射只能选择性损伤大鼠睾丸而不引起其他***改变。李维信［3～6］等的研究则认为该剂量的CdCl2不仅损伤睾丸，而且可致附睾、精囊腺及输精管超微结构损伤及AlPase、TPPase和G-6-Pase活性降低。Hoffmann［9］等报道用较大剂量的CdCl2(4.5 mg/kg～10.05 mg/kg体重)腹腔内多次注射后170～240 d，可致大鼠前列腺上皮主细胞出现不典型增生。Battersby［7］等研究结果表明含5 ppmCdCl2饮水喂养20周后，大鼠前列腺腹侧叶上皮无明显超微结构改变，而含50 ppmCdCl2饮水52周后，见主细胞出现不典型增生，但未见癌细胞。本研究结果表明：镉注射后4 h，大鼠前列腺腹侧叶主细胞已出现线粒体肿胀和髓样结构，24 h后改变加重，3～7 d损伤最明显，主要表现为线粒体肿胀，高尔基复合体扁平囊泡扩张，排列紊乱。15 d以后退变有所减轻。60 d后主细胞基本恢复正常，但部分主细胞的线粒体仍有轻度肿胀。
　　本研究所见镉所致前列腺上皮主细胞的早期损伤系肿胀溶解性的病理改变，与我们在睾丸、附睾、精囊腺及输精管所见的改变相似，说明镉对前列腺主细胞也有直接损伤作用。镉损伤机理与脂质过氧化作用有关，它可能通过抑制超氧化物岐化酶(SOD)活性，使活性中间氧水平升高，间接诱发细胞膜脂质过氧化，而致膜通透性增高。也有人认为游离的镉离子能抑制定位于膜上的磷脂合成酶系，最终使膜的类脂构成发生改变而致细胞损伤［5］。本研究结果见大鼠前列腺主细胞早期的损伤以线粒体及高尔基复合体为主，而RER的改变很轻，这与我们在附睾及精囊腺所见有不同，其原因尚待进一步研究。15 d以后主细胞出现RER排成的同心圆小体及池内封隔现象，以及溶酶体数量增多，可能与镉能损伤睾丸间质细胞而致雄激素水平下降有关［4］。文献报道大鼠阉割后4 h，可见前列腺腹侧叶主细胞的RER呈同心圆状排列和自噬体形成，溶酶体数量增多［1，11］。对RER的同心圆小体出现原因有不同的观点，有人认为这是一种细胞退行性改变，也有人认为是增生性变化。一般认为池内封隔是含RER丰富的细胞处理过剩RER或细胞萎缩的表现，而上述两者皆与自噬体形成有关［12］。
　　TPPase是高尔基复合体的标志酶，与高尔基复合体内糖基化过程中的糖基转移酶活性有密切关系，它定位于成熟面扁平囊泡，系细胞合成分泌功能状态的重要标记。镉注射后4 h，TPPase反应产物明显减少，3 d和15 d进一步减少。4 h和3 d组TPPase反应产物减少与镉对主细胞的直接损伤所致肿胀溶解性改变有关［3～6］。此外该酶反应产物的减少还先于超微结构的改变，这也提示镉具有直接损伤作用。豚鼠阉割后6周前列腺背侧叶及精囊腺主细胞高尔基复合体的TPPase反应产物才有减少，说明雄激素水平下降所致的损伤出现较晚［4］。陶均等［13］用Tamoxifen (100 mg/kg体重)喂养大鼠5 d后见前列腺腹侧叶主细胞TPPase反应产物减少。本研究所见镉注射后15 d出现的TPPase反应产物明显减少，提示与镉致睾丸间质细胞损伤所引起的血清睾酮浓度下降的进一步加重损伤有关。
　　锌是维持哺乳动物生殖***功能不可缺少的微量元素。我们曾报道锌对镉所致大鼠睾丸、附睾及输精管损伤皆有良好的保护作用［3，5，6］。正常人血浆锌镉浓度的比值仅为前列腺组织的1/3，在前列腺疾病(前列腺增生及前列腺癌)状态下，这一比值明显变大［8］，说明锌对维持前列腺的正常功能具有重要的作用。本研究结果表明，锌对镉所致前列腺主细胞的超微结构损伤及TPPase活性均有明显的保护作用。其机理可能与通过诱导金属硫蛋白(MT)的产生，以更多的Cd-MT结合形式贮存在胞质内，以及锌能直接与镉竞争主要大分子上的高亲和位点，从而减少镉的直接损伤作用有关。本研究15 d锌保护组TPPase反应产物的明显增多，可能与锌对镉所致睾丸间质细胞损伤所具有的保护作用，促使前列腺主细胞退变减轻有关。
本文图1～12见插图第17，18页
图1　正常大鼠前列腺腹侧叶主细胞，可见细胞核(N)、粗面内质网(RER)、高尔基区(↑↑)、线粒体(▲)、分泌颗粒(↑)、腺腔(Lu)　×5 000
　　Fig.1 Principal cells of ventral prostate from normal rat. N,RER, rough e Golji region(↑↑); Mitochdria(▲);secretory granule(↑);Lu,lumen.×5 000
图2　镉注射后4 h，细胞核(N)正常，线粒体内可见髓样结构(My)　×10 000
　　Fig.2 4h after Cd treatment, N, My, mylin figure in Mitochondria and plasma membrane.×10 000
图3　镉注射后3 d，高尔基复合体(Go)扩张，线粒体(Mi)肿胀，并有髓样结构。粗面内质网基本正常　×10 000
　　Fig.3 Dilation of Golji complex(Go) and swelling of mitochondria(Mi) of principal cell from 3 days after Cd treatment.×10 000
图4　镉注射后15 d，高尔基复合体轻度扩张，溶酶体(Ly)、粗面内质网基本正常　×8 000
　　Fig.4 Milder dilation of Golji complex(Go); Iysosome(Ly) of principal cell from 15 days after Cd treatment.×10 000
图5　镉注射后30 d，主细胞粗面内质网形成的内同心圆性小体，其内有溶酶体和肿胀的线粒体(Mi)，并可见池内封隔(▲)　×20 000
　　Fig.5 Concentric lamellar body of RER from 30 days after Cd treatment. Mi, Ly, ▲,Intracisternal sequestration of RER　×20 000
图6　镉锌联合注射后3 d，主细胞线粒体肿胀，细胞核、高尔基复合体轻度扩张，Lu.腺腔　×10 000
　　Fig.6 Swelling of mitochondria(Mi),N, and milder dilation of Golji complex(Go); lumen(Lu) of 3 days Cd+Zn treatment.×10 000
图7　镉锌联合注射后15d,主细胞基本正常。×8000
　　Fig.7 Principal cells almost normal of 15days Vd+Zn treatment.×8000
图8　正常大鼠前列腺主细胞高尔基复合体TPPase反应产物多。×25000
　　Fig.8 TPPase reactive product of Go in principal cell from prostate of normal rat.×25000
图9　镉注射后3d,主细胞高尔基复合体TPPase反应产物。×25000
　　Fig.9 TPPase reactive product of Go in principal cell from prostate 3 days after Cd treatment.×25000
图10　镉注射后15d，主细胞高尔基复合体TPPase反应产物。×25000
　　Fig.10 TPPase reactive product of Goin principal cell from prostate 15 days after Cd treatment.×25000
图11　镉锌联合体注射后3d，主细胞高尔基复合体TPPase反应产物。×25000
　　Fig.11 TPPase teactive product of Go principal cell from prostate 3 days after Cd add Zn treatnent.×25000
图12　镉锌联合注射后15d，主细胞高尔基复合体TPPase反应产物。×25000
　　Fig.11 TPPase teactive product of Go principal cell from prostate 15 days after Cd add Zn treatnent.×25000
　　【作者简介】　罗子国(1963—)，男(汉族)，四川剑阁县人，医学硕士，讲师
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专利名称生长激素的非注射性制剂及其用途的制作方法
技术领域本发明属于蛋白质制剂学及其应用领域，更确切地说，属于生长激素的制剂及其应用领域。
背景技术人生长激素由脑垂体前叶的嗜酸性颗粒细胞产生和分泌的一种内分泌激素，这种激素与人体的生长发育和正常生理功能的维持直接相关。生长激素也可由重组DNA技术做体外表达。体外表达生产的生长激素与人体内合成的生长激素仅一个氨基酸的差别。在天然激素的氨基酸末端多一个蛋氨酸，但两者的生物学效应相同。因此，本发明利用体外合成的生长激素作为体外实验与体内试验的样品。
人生长激素的分泌在不同的年龄段有较大的不同，从儿童到青春期，生长激素的分泌量递增，青春期达到高峰。然后，随年龄的增加而分泌量递减。中年之后人生长激素的分泌量降至最低程度。为此，人们认为生长激素的分泌量降低可能与人体的衰老有直接的联系。本发明利用生长激素这一分泌特点与人体生理机能衰老相关联，发明一种新型的补充生长激素的方剂和方法，适量补充其分泌不足，以达到延迟人体的衰老，增加人体机能的活力，减少疾病发生和改善生活质量。(Bewley T.A.et al；Adv Enzymol；42；73-166；1975；Frankenne F.et al；JCiin.Endocrin and Metabol；66；88.)人生长激素是由191个氨基酸组成的单链多肽，生长激素存在于溶液中，易发生如下结构上的破坏和改变(1)形成多聚体生长激素多肽链容易聚合成二聚体，三聚体和四聚体。影响生物活性和吸收。(2)肽链的断裂特别是溶液受到蛋白酶的污染时，造成生长激素肽链的断裂，从而影响生物活性。(3)脱氨基作用蛋白质肽链中存在谷氨酰胺和门冬酰胺很容易被水解或环化成琥珀酰胺的中间产物，这种脱氨基作用可产生不同量的降解产物。生长激素在149位和152位氨基酸处易发生脱氨基作用。(4)氧化作用生长激素分子上的14位和125位氨基酸易发生氧化，特别是在溶液中，在氧化作用后形成氧化硫，氧来源于空气。(5)粘附作用生长激素可能粘附在容器表面使溶液中的有效浓度降低。在气-液界面的生长激素易失效。在生长激素缺乏性疾病的治疗中，唯一的给药途径是通过注射法，(Y.-C.J.Wang and M.A.Hanson，J.Parenteral Science andTechnology 42(Suppl.)(；M.C.Manning，K.Patel，R.T.Borchardt，PharmaceuticalResearch 6(11)(；and B.A.Johnson，J.M.Shirokawa，W.S.Hancock，M.WSpellman，L.J.Basa and D.W.Asward，J.Biol.Chem.264，9)；L.C.Teh et al.，J.Biol.Chem.，262，785-794(1987)；G.W.Becker et al.，Biotech.Appl.Biochem.，10，326-337(1988)；R.A.Houghten et al.，Arch.Biochem.Biophys.，178，350-355(1977)；R.M.Riggin et al.，Anal.Biochem.，167，199-209(1987)；P.Gellerfors et al.，Acta Paediatr.Scand(suppl)，370，93-100(1990)；and M.J.Kaufman，Pharm.Res.，7(3)289-292(1990))使生长激素得到足够量的补给，以达到治疗疾病的目的。随年龄的增加而生长激素分泌量下降的额外补充，如果也经注射来达到目的，甚为不便，也不被人们接受。
怎样才能用非注射的制剂和方式来满足这一需要，是蛋白质制剂学上的一项重任。
本发明的目的是提供一种稳定的生长激素非注射性制剂，由生长激素和生长激素稳定剂组成，生长激素稳定剂包括(1)锌选自氯化锌、硫酸锌、醋酸锌、氧化锌、溴化锌之一；(2)乙醇；(3)氯化钙；(4)维生素C；(5)各种氨基酸如赖氨酸，精氨酸，门冬氨酸，谷氨酸等；(6)多醇化合物如甘油，山梨醇，甘露醇，糖基乙醇，乳糖，各种葡聚糖，等等；(7)枸椽酸盐如枸椽酸钠等。
这些稳定剂的作用(1)保持生长激素在溶液中的稳定性，使其化学结构和生物学活性不受损害。(2)有效的传递方式，可以将生长激素分子完整地传递到血液循环系统，或者作用部位。
本发明优选的制剂是一种溶液制剂，可以使生长激素在溶液中具有化学结构的稳定性，和完好的生物活性，在应用中具有较好的穿透性。现将本发明的稳定剂进一步分述如下(1)锌的应用锌离子带有二价阳电荷，与生长激素相结合使生长激素的结构趋于更加稳定，且不影响其生物学活性。也有人认为对用DNA重组技术产生的生长激素与锌结合，可使其生物学活性增加。本发明中，使用锌的无机盐，包括但不限于醋酸锌，氯化锌，溴化锌，氧化锌，硫酸锌。其浓度在0.2～1.0mMol/L，可与适量的钙同时使用。本发明的溶液制剂中，锌的浓度为0.4mMol/L，用氯化锌的盐溶液，与2mMol/L的氯化钙配伍，可使生长激素稳定时间延长，化学结构更趋于稳定，而且形成多聚体的机会减少。
(2)最佳pH值的选择生长激素分子的等电点为5.2。生长激素在体内发挥生物效应的酸碱环境在pH6.8到7.5的范围内。本发明选择生长激素溶液制剂的pH值在pH6.8到7.5。系列pH值溶液的试验结果表明，生长激素在pH6.8-7.2的溶液中分子结构最稳定。
(3)维生素C的选择本发明选择维生素C配于溶液中，使溶液具有氧化缓冲作用，使用浓度在100-200mMol/L，实验证实具有维生素C的溶液，生长激素的分子结构趋稳定。
(4)氨基酸溶液选用多种氨基酸于溶液中，可使生长激素在溶液中的稳定性加强。也有不少研究表明，某些氨基酸的多聚体能够加强蛋白质在溶解状态下的稳定性，特别认为多聚赖氨酸，多聚门冬氨酸，多聚谷氨酸，多聚精氨酸等，对生长激素的分子结构具有稳定作用。本发明研究中，利用20种氨基酸的盐溶液，在生理pH值范围内，对生长激素的分子结构的稳定有加强的作用，对其生物活性保持有协同作用。
(5)多醇化合物(polyol)和其它大分子物质溶液的选择这些物质包括了甘油、山梨醇、甘露醇、糖基乙醇、糖酸、多戊四醇、乳糖、各种葡聚糖等，均证明有稳定生长激素化学结构的功能。本发明利用甘露醇溶液，以增强生长激素在溶液中的稳定性。
(6)基本生理盐液的选择本发明以两种基本缓冲盐液为母液，然后配制成不同的稳定剂。一种为磷酸生理盐液，二是枸椽酸缓冲盐液。任何稳定剂的配制，均将pH值调至6.8至7.2之间。
酒精(乙醇)溶液在生长激素非注射性制剂中的作用乙醇浓度从10-100％，对生长激素在溶液中的分散程度和化学结构的稳定性均有重要作用。
(1)本发明选用5-40％的乙醇溶液为生长激素的溶液制剂，实验研究证明，该溶液中的生长激素保持良好的化学稳定性和生物学活性。
(2)乙醇可以增加生长激素的粘膜吸收。局部应用乙醇可以使局部的血管扩张，血夜循环加快，血流量增加。当乙醇配伍药物时，可使该药物的吸收加快，吸收量增加。本发明研究中，将生长激素与乙醇溶液配伍使用，除了上述作用之外，乙醇还能增加生长激素的局部穿透作用。特别是作口腔粘膜应用时，能够增加生长激素透过粘膜上皮间质和粘膜上皮质膜的作用，使生长激素得以吸收。这种吸收量可能存在不均衡性，也难以达到治疗所需的浓度。但这种吸收方式和量对人体的许多生理机能的促进和维持可能有重要作用，对于人体各***组织的更新和代谢也可能有促进作用。这对人体额外补充生长激素可能是最好的制剂与方式。
(3)乙醇溶液具有防腐性。一定浓度的乙醇溶液，可以抑制细菌的污染，也可以抑制酶的活性。使溶液保持在无污染的状态下，生长激素在溶液中的稳定性也由此得到保障和加强。
生长激素非注射性制剂的应用方法非注射性用药途径包括口服用药经胃肠道吸收，生长激素为一种多肽物质，在经过胃肠道时，胃肠道分泌的许多肽酶，蛋白酶可使其破坏。不能达到用药的目的。粘膜用药也是一种常用的方法，其中的口腔粘膜，直肠粘膜用药更为常见。通过透皮传递用药也是近年来常见的方法，但由于皮肤结构厚，通透性的获得是一件难的事情，生长激素大分子物质，难以通过该途径达到补充的目的。患部局部用药，某些外伤、溃疡等处可以直接用药，以达到治疗的目的。本发明中，将生长激素的非注射性制剂作如下两方面应用1、口腔粘膜用药口腔粘膜给药，药物可以直接吸收入血，达到用药的目的，是一种常用的给药途径。通过口腔粘膜给药的优点有①口腔粘膜含有丰富的血管，血循良好，药物通过粘膜相对容易到达全身血液循环。②口腔粘膜具有较好的通透性，口腔内给药较易通过粘膜上皮，达到血循环系统。③避免了所给药物首先通过肝脏，经其肝的代谢活动而减弱药效的缺点。④避免了所给药物通过胃肠道，在胃肠道内经消化酶的作用而破坏***，特别是蛋白类的药物。⑤口腔粘膜给药方便，无痛苦。
口腔粘膜用药的部位常有①舌下粘膜用药，②颊粘膜用药，③患部用药。其中舌下粘膜给药效率最好，舌下粘膜的上皮结构薄弱，上皮无角质化层，药物容易穿透粘膜上皮达到粘膜下血管网，吸收入血，使药物在短时间内血中的浓度达到高峰。而颊粘膜对药物的穿透性差，需要特别的药物传递系统。
本发明设计生长激素非注射制剂时，根据口腔粘膜上皮结构与物质传递穿透的特点来设计的。口腔粘膜上皮间隙基质富于亲水性，而对亲脂性物质溶解度较低。粘膜上皮质膜亲脂性强，对亲水性物质溶解度较低。因此，不同的协助药物传递与穿透的媒介有不同的部位选择。口腔粘膜表面，附有一层粘液，粘蛋白与碳水化合物形成网状的分子结构，带有负电荷，呈胶状覆盖于上皮表面。这种负电荷主要由盐酸与硫基所致。这层粘液可以减缓或阻挡物质向粘膜内穿透，特别是蛋白质类的物质。本发明所设计的生长激素溶液，主要用于口腔粘膜，通过口腔粘膜吸收入血，并产生其生物效应。这种制剂用喷雾的方式，将生长激素喷散在舌下粘膜，其中的媒介使粘液层的屏障清除，使生长激素直接与上皮质膜和上皮间隙接触，并在媒介的介导之下，使生长激素通过上皮质膜和上皮间隙进入血循环。
2、肺部吸入法肺是血循最丰富的***之一，而肺泡上皮和气管与支气管的粘膜上皮较易穿透，是给药的常用途径。肺部给药的方式大至有两种，一是将药物制备成微粒(尘状)，将微粒向肺部内喷洒，药物可经呼吸道上皮吸收入血，已有报道将生长激素用此方法给药，使其通过上皮吸收，收到良好的效果。二是以喷雾的方式给药。本发明研究中，将其生长激素的水溶剂，通过雾化吸入法，使生长激素到达肺内，达到给药的目的。生长激素雾化吸入的给药方式，是本发明研究中的一项重要成果，无先前报告。
3、局部给药本发明研究中将生长激素的水溶制剂用于患部达到治疗疾病的目的。在试用中，生长激素的局部喷洒，可以治疗口腔溃疡，也可以用于皮肤的一些慢性溃疡病，如褥疮，糖尿病脚部溃疡，静脉性溃疡，皮肤烧伤等。本发明研究中，发现生长激素的局部应用可以加快伤口或溃疡的愈合作用。
4、皮肤保养与美容本发明的实验研究中，发现生长激素具有表皮细胞营养作用。人体表皮细胞含有丰富的生长激素受体，当生长激素与其结合时，可加强细胞的代谢，培养中细胞显得“年轻”和细胞数量增加。本发明设计了美容液和美容霜两种形式，应用于皮肤保养、抗老化效应和某些皮肤疾病的治疗。配方和应用方法见研究实例部份。
实施例以下实施例仅用于说明本发明，不应理解为对本发明的任何限制。
原料本发明所用试剂均来源于美国SIGMA公司。
实例1生长激素稳定溶液的筛选在本发明研究设计中，用基本缓冲液加不同的组合配方溶液进行研究筛选，最后选出八组基本配方来进行体外生长激素在溶液中的稳定性实验。每组实验配备好之后，放置在室温(22-25℃)下，避光保存，分别在储存后一月，二月，三月和六个月时，进行生长激素的化学结构分析和生物活性测定。下表中列出实验组及配方成分。
(1)稳定性实验-I八种稳定溶液的基本成分
STB代表稳定溶液(Stabilizer Buffer)；PBS代表磷酸缓冲生理盐液
(2)稳定性实验-II八种稳定溶液的基本成分
STB代表稳定溶液(Stabilizer Buffer)；CTB代表枸橼酸缓冲生理盐液。
(3)稳定性实验结果评判
(4)结果说明+化学结构-三个月后，rhGH主带消失，断裂带为主，有多聚体带的存在；生物学活性消失。
++化学结构-三个月后，rhGH主带可见，断裂带明显，有多聚体带的存在；生物学活性较差。
+++化学结构-三个月后，rhGH主带明显，断裂带和多聚体带模糊可见；生物学活性存在。
++++化学结构-三个月后，rhGH主带为主，断裂带和多聚体带不可见；生物活性良好。
(5)稳定性实验-III实验稳定溶液的组成
STB代表稳定溶液(Stabilizer Buffer)(6)稳定性实验-IV实验稳定溶液的组成
STB代表稳定溶液(Stabilizer Buffer)；PBS代表磷酸缓冲生理盐液
(7)结果说明-化学结构，rhGH主带消失。
+化学结构，rhGH主带与断裂带同时存在，有多聚体带的存在。
++化学结构，rhGH主带可见，断裂带明显，有多聚体带的存在。
+++化学结构，rhGH主带明显，断裂带和多聚体带模糊可见。
++++化学结构，rhGH主带为主，断裂带和多聚体带不可见。
实例2人体试用-1本发明采用STB-8，每毫升含12微克生长激素，每60毫升装入喷雾瓶内供自愿者试用。
自愿试用者的选择主要根据年龄和一些与年龄有关的症状，这些症状与表现有(1)试用者近一、二年来显得易身心疲惫，精神较紧张，注意力不集中，工作效率较低下，而过去并无此表现。(2)试用者睡眠质量较差，或有失眠的现象，无过去史。(3)晚间吃饭后，自觉消化不好，夜间反胀。(4)有多处关节或背部不适的感觉，即“腰腿不灵便”的现象。(5)心跳较快，一般每分钟80次。(6)性欲减退。(7)早晨起床眼周发青和“浮肿”现象。(8)医院超声波检查证实前列腺有轻度肥大，时有尿频尿急的感觉。本发明研究中选用了六个试用者，年龄在50岁以上。
使用方法试用者每天清晨起床时，舌下喷雾二次，喷雾之后保持不吞咽大约3-5分钟，舌头不断转动摩擦，促使吸收。最后将口中剩余部分咽下。晚间睡觉之前用相同的方式喷雾二次。用量是每次喷雾为1.8微克/0.15毫升，每日其用量为7.2微克。试用者必须不间断用药二个月。
临床观察六个受试者，采用生长激素喷雾十天之内无任何症状改善。于十四天之后，六个中有五个自愿者有不同程度的症状改善，首先改善的症状是睡眠质量提高，对注意力不集中，饭后反胀，腰膝酸软等均有不同程度的改善，反应更好者有改善性欲低下和尿频尿急等。
结论舌下粘膜应用本发明新制备的生长激素非注射品，有改善人体某些与年龄相关的“衰老”现象。
实例3人体试用-2生长激素的喷雾剂，制剂与实例2相同。自愿试用者的选择主要是自愿者在近期内发生了口腔溃疡，溃疡周边红肿，中央溃烂，自觉疼痛。本发明选到二位自愿者。共三个溃疡面。
使用方法将生长激素直接喷在溃疡之上。每日三次。
临床观察二位患者在喷上生长激素之后，2-4小时内疼痛减轻，8-14小时内自觉良好，疼痛几乎消失。24小时后红肿减轻，溃烂面缩小。48小时后溃烂面消失，红肿颗粒缩小，甚至消失。
结论本发明制备的生长激素喷雾剂对口腔粘膜溃疡有明显的治疗作用。
实例4人体美容试用(1)皮肤美容制剂的配制美容液体基本方的配制30％变性酒精，1％聚二甲基鲑氧烷(Dimethicone)，甘油，安息香酸，樟脑，丁香油，灰杨柳油(Eucalyptus Globulus oil)，香料和水。
将含有1.0毫克生长激素(1.0毫升)溶液加入到1000毫升的皮肤美容液体中。供皮肤美容用。
美容霜基本方的配制水，1％聚二甲基鲑氧烷(Dimethicone)，甘油，二硬脂氯化二稀土(distearyl dimonium chloride)、凡士林、异丙基软脂酸、甲基软脂酸、鲸腊醇、苯甲醇、氯化钠、21-硬脂、辛酸甘油三脂、葵酸甘油三脂、向日葵花油、向日葵子油、大豆固醇、卵磷脂、维生素E、视黄醛棕榈酸酯、尿素、胶原蛋白氨基酸、硬脂先乳酸钠、矿泉水、sodium PCA，异硬脂先乳酸、硬脂先硬脂酸盐、香料、com oil、EDTA二钠、丁烯乙二醇、氯化钠、氢苯甲酸甲脂(methylparaben)、对氢苯甲酸甲脂(propylparaben)、二偶氮利定尿(diazolidinylurea)、BHT、二氧化钛。
将含有1.0毫克生长激素液(1.0毫升)溶液加入到1000毫升的皮肤美容霜中。供皮肤美容用。
(2)人体试用皮肤美容剂包装在100毫升美容包装瓶，有色避光，消毒。选择五位四十五岁以上的妇女，她们的面部经常有轻度的发炎，毛囊感染，和皮肤干燥。应用方法是将皮肤清洗晾干后，使用一次，或者自觉皮肤干燥时使用。但每天至少使用一到两次。结果表明，含有生长激素美容制剂具有美容，抗皮肤干燥，抗皮肤皱纹，和抗皮肤衰老的作用。
1.一种生长激素非注射性制剂，由生长激素、生长激素稳定剂和缓冲液组成。
2.根据权利要求1所述的生长激素非注射制剂，其特征在于该制剂中生长激素的量可为每毫升0.1微克到10毫克。
3.根据权利要求1所述的生长激素非注射制剂，其特征在于该制剂中含有锌，其浓度为0.1毫摩尔到1.0毫摩尔。锌选自氯化锌、硫酸锌、醋酸锌、氧化锌、溴化锌之一。
4.根据权利要求1所述的生长激素非注射制剂，其特征在于该制剂中含有乙醇，其浓度为5％到40％
5.根据权利要求1所述的生长激素非注射制剂，其特征在于该制剂中含有不同的生长激素的稳定剂，这些稳定剂可为但不限于(1)氯化钙；(2)抗氧化剂如维生素C等；(3)各种氨基酸如赖氨酸，精氨酸，门冬氨酸，谷氨酸等；(4)多醇化合物如甘油，山梨醇，甘露醇，糖基乙醇，乳糖，各种葡聚糖，等等；(5)枸椽酸盐如枸椽酸钠等。
6.根据权利要求1所述的生长激素非注射制剂，其特征在于该制剂的pH值为6.8至8.5之间。
7.根据权利要求1所述的生长激素非注射制剂，其特征在于该制剂为一种非注射性剂型，可为但不限于(1)溶液；(2)膏剂；(3)散剂；(4)栓剂；(5)片剂；(6)胶囊制剂；(7)乳化剂；(8)气雾制剂；(9)膜剂；(10)海绵剂；(11)微囊制剂；(12)脂制体制剂；(13)丸剂。
8.根据权利要求1所述的生长激素非注射制剂，其特征在于该制剂可经如下途径吸收(1)粘膜包括口腔粘膜，呼吸道粘膜，胃肠粘膜，***粘膜，鼻粘膜等；(2)肺泡上皮；(3)皮肤；(4)眼结合膜；(5)表面伤口包括溃疡，褥疮，烧伤，创伤等。
9.根据权利要求1所述之生长激素的非注射性制剂，其特征在于该制剂可为机体补充外源性生长激素，可用于(1)保健品；(2)美容制剂和(3)治疗药品。
10.根据权利要求9所述之保健品，主要用于但不限于(1)改善人体与年龄相关的“衰老现象”；(2.)增加人体的活力；(3)帮助人体的生长发育；(4)提高机体的抗病能力等等。
11.根据权利要求9所述之美容制剂，主要用于但不限于(1)美容；(2)抗皮肤邹纹；(3)抗皮肤衰老等等。
12.根据权利要求9所述之治疗药品，主要用于但不限于(1)皮肤与粘膜的损伤与溃烂；(2)各种由于生长激素不足所致的疾病如生长发育障碍；(3)机体各种退化性疾病。
一种生长激素的非注射性制剂，由生长激素和生长激素的稳定剂组成。生长激素稳定剂是具有稳定生长激素的化学结构和生物活性并且增强生长激素穿透性的物质，包括锌，乙醇，多醇聚合物，维生素C，枸椽酸钠，多种氨基酸。该制剂可经非注射途径向人体提供外源性生长激素，发挥保健、美容和治疗作用。
文档编号A61K38/27GK
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发明者王正品, 吕渭川 申请人:天津国韵生物科技有限公司