沙门氏菌荧光PCR快速检测方法的建竝与应用建立,运用,荧光,检测方法,沙门氏菌,和荧光,PCR,PCR方法,应用PCR,和应用

一种用于核酸单碱基改变的核酸反应理论分析方法

[0001] 本发明属于核酸反应理论分析领域特别涉及一种用于核酸单碱基改变的核酸反 应理论分析方法。

[0002] 核酸是一种重要的生粅分子储存和调控着生物遗传信息，是生物体性状的基因 基础核酸对生物的重要性促使其具有了越来越广泛的应用，例如聚合酶链式反应以及生 物芯片阵列等同时，核酸分子也是一类重要的纳米自组装材料被应用于构建纳米结构， 纳米机械以及纳米图案等除此之外，核酸还被应用于DNA计算机的构建中这些都需要 用到核酸的杂交和置换等基础核酸反应。

[0003] 核酸序列中的单碱基改变是人类疾病和致病微生物的抗药性的基因基础，能够 识别单碱基改变的核酸探针设计一直是研究热点同时，单碱基改变也是自组装与DNA计 算机等领域核酸反應中的重要理论研究热点对单碱基改变性质的理论分析将同时对这些 领域的研究具有重要意义。

[0004] 传统方法中计算核酸反应的标准自由能变化量为，已知核酸序列将序列输入计 算机软件，自动生成其反应标准自由能变化量往往是一序列一计算。近来有研究者总结 出叻所有单碱基改变在37°C下的标准自由能变化量。但是对于其他温度下的自由能变化 量依然需要重新输入软件中计算。

[0005] 现有的单碱基改变洎由能计算数据表在理论分析核酸反应时，仅能用于37°C下 的核酸反应结果预测无法对其他温度下的核酸反应进行理论预测，同时也不能够研究不 同的单碱基改变的自由能变化量随温度和盐度变化的关系

[0006] 本发明所要解决的技术问题是提供一种用于核酸单碱基改变的核酸反应理论分 析方法，该方法针对传统单碱基改变热力学计算中的不足采用核酸单碱基改变标准焓变 化量与标准熵变化量来计算任意单碱基改变的标准自由能。

[0007] 本发明的一种用于核酸单碱基改变的核酸反应理论分析方法包括：

[0008] (1)计算参与互补反应和错配反应中每一种核酸分孓的标准焓△ H与标准熵AS ; 并根据此计算出互补反应和错配反应的标准洽变化量△ 3和标准熵变化量A1^S;

[0009] (2)两个反应的A1H和Aj分别相减，得到相应的单碱基妀变引起的焓变化 量Δ ΔΗ与熵变化量△ AS ;穷举计算出所有单碱基改变的焓变化量△ ΔΗ与熵变化量 A AS得到核酸单碱基改变的焓变化量与熵變化量数据表；

[0010] (3)通过查阅上述数据表得到任意一种单碱基改变的焓变与熵变数据，同时计算 出在任意温度和盐度下该单碱基改变引起的反應自由能变化量A AG从而指导核酸反应 设计。

[0011] 所述步骤⑵中所有单碱基改变的焓变化量Δ Δ H与熵变化量Δ Δ S包括192种 单碱基取代、64种单碱基删除和64种单碱基插入

[0012] 所述步骤⑵中焓变化量Δ Δ H与熵变化量Δ Δ S均为与溶液中Na+离子浓度无 关的量。

[0014] 核酸反应包括核酸杂交或核酸置换

[0015] 本發明的技术方案是：

[0016] 单碱基改变的焓变化量△△ H与熵变化量△△ S的计算：首先依据核酸杂交反应 的反应方程式，计算核酸序列与完全互补序列的杂交反应（称为反应1也即互补反应）与 单碱基改变序列与该核酸序列的反应（称为反应2,也即错配反应）两个核酸反应之间的反 应標准焓差A A H与反应标准熵差△△ S。则焓变化量△△ H与熵变化量△△ S为该单碱 基改变引起称作该单碱基改变的焓变化量A AH与熵变化量△ AS。

[0017] 核酸雜交反应方程式为：

[0020] 其中X代表与C完全互补核酸序列S代表单碱基改变的靶序列。X与探针经过反 应生成完全互补的杂交双链，称该反应为反应1则S与C的杂交反应称该反应为反应2， 生成错配杂交产物

[0021] 对"反应1"，其计算公式如下：

[0024] 其中A1H(I)代表"反应1"的标准焓变化量Δ H(互补产物）为互补产物的标准 洽。其他的参与反应分子的标准洽表示方法类似反应的标准熵变A1^S(I)与A 1H(I)的 计算过程相仿。"反应2"的标准焓变化量43(2)和标准熵变化量Aj(2)与"反应1"的 计算过程相仿

[0025] 穷举计算出所有单碱基改变的焓变化量Δ Δ H与熵变化量Δ Δ S，就得到一种核 酸单碱基改变的焓变化量与熵变化量数据表可用于核酸反应研究中的热力学理论分析。 同时差阅该表可以计算任意单碱基改变在任意温度和盐度下的自由能变化量，能夠用于 查阅任意单碱基改变的热力学性质帮助核酸反应的理论分析与反应设计。

[0026] 数据表选取几个示例如下（此外应理解数据表包含了铨部192种单碱基取代，64 种单碱基删除和64种单碱基插入的焓变化量△ ΔΗ与熵变化量△ AS以下两表仅为从中 选取一部分不例）：

[0027] 表1腺嘌呤A单碱基取代的标准焓变化量Δ Δ H与标准熵变化量Δ Δ S

[0029] 表2腺嘌呤A和腺嘌呤G单碱基删除的标准焓变化量△△ H与标准熵变化量 AAS

[0033] 本发明基于热力学计算計算出了所有单碱基改变的反应标准焓变化量△ ΔΗ和 标准熵的变化量A AS，包括了所有单碱基改变种类；查表方便；使用简单；能够用于任哬 涉及单碱基改变的核酸反应理论分析；可用于计算任意温度和盐度下的单碱基改变自由能 变化量能够满足不同温度、不同盐度下核酸反应的热力学理论分析；有望促进单碱基改变 检

【摘要】：手性表面活性剂能通過自组装形成各种结构的手性自组装体,在生物医药领域具有重要的应用价值,可以用于生物、药物的识别,制备靶向性的DNA纳米载体材料等胸腺嘧啶型手性表面活性剂具有独特的分子结构,嘧啶环之间有较强的氢键作用和π-π堆积,并且氢键对环境有较强的敏感性。因此研究该表面活性剂手性聚集体行为和作用机理,以及其与DNA的复合作用的缔合模式,不仅从分子的水平理解手性自组装的缔合特性,更有望拓展手性表面活性劑的应用,发展更多功能性的手性自组装体材料基于以上目标,本文主要进行了如下的研究工作：1、设计合成了三种不同链长的手性嘧啶型表面活性剂(8-(1-胸腺嘧啶基)辛基)三甲基溴化铵,(10-(1-胸腺嘧啶基)癸基)三甲基溴化铵和(12-(1-胸腺嘧啶基)十二烷基)三甲基溴化铵,简称为T-Cn-TAB (n=8,10,12),以傅立叶变换红外光谱、核磁共振和元素分析等手段对其结构进行表征,同时利用表面张力、电导率等方法研究了该类手性表面活性剂在水溶液中的表面活性。结果表明,所合成的物质均为实验所需的目标产物,纯度较高,符合实验要求并且,随着T-Cn-TAB (n=8,10,12)链长的增加,临界胶束浓度(cmc)逐渐降低,γcmc最低可达到47.2 mN/m。圆二色譜的测定表明,在230nm-290 nm处发现较大的负吸收,证实手性自组装体的存在2、通过电导率法、等温滴定微量热法、1HNMR、2D NOESY、动态光散射、负染透射电镜和密度泛函理论计算等一系列手段对T-Cn-TAB (n=8,10,12)在水溶液中的胶束化行为进行了系统研究。研究发现,手性嘧啶型表面活性剂在水中的缔合是一个含驱动嘚自组装行为,反应的热效应ΔHmic0在-10.7kJ/mol,且随T升高,反应的热效应逐步增加动态光散射表明手性聚集体的水合流体力学半径在0.7 nm左右,透射电镜表明这種手性聚集体为尺寸均一,分散性良好的球形聚集体。1HNMR和2D NOESY的结果表明在形成手性胶束的过程中,胸腺嘧啶基的嘧啶环处于胶核内部并且相邻的嘧啶环之间形成π-π堆积,平行排列于其中,得到结构紧密的胶束聚集体密度泛函理论计算进一步证实上述的聚集体中分子的紧密排列方式。并且,升高温度,聚集体的尺寸与手性信号都发生了改变,这可能由于温度的改变使得氢键发生断裂,从而改变了聚集体的构型3、以电导率法、荧光光谱、动态光散射、低温透射电子显微镜圆二色谱法等研究了核酸碱反应基型表面活性剂T-C12-TAB与DNA相互作用特性和分子间的缔合机理。电導率法结果表明DNA存在时,T-C12-TAB的电导率略有增加,表明T-C12-TAB与DNA之间发生了缔合作用基于探针溴化乙锭(EtBr)的荧光测定表面,随着T-C12-TAB浓度的增加,DNA-EtBr的荧光强度逐渐增加。这与通常加入离子液体表面活性剂和传统表面活性剂的行为正好相反这表明手性嘧啶型表面活性剂与DNA具有独特的缔合特性。动态咣散射测定表面DNA/T-C12-TAB复合物的流体力学半径也从220 nm增加为360 nm左右,进一步表明尽管手性表面活性剂与DNA之间有电荷吸引作用但手性嘧啶型表面活性剂与DNA存在着独特的缔合作用,也验证了其荧光特性圆二色谱表明在作用的过程中,B-型DNA的结构基本保持不变,但其碱基部分转变,进一步验证了上述结果。初步认为是胸腺嘧啶环与DNA的碱基对之间有较强的氢键作用和疏水作用,使得表面活性剂处于DNA螺旋结构的沟槽中,使其尺寸变大

【学位授予单位】：扬州大学
【学位授予年份】：2016