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摘要 : Ni柱中的氯化镍或者硫酸镍可以与有HIs(组蛋白)标签的碱性蛋白蛋白结合，组蛋白标签一般是6个组氨酸(碱性氨基酸)。在蛋白上样后，带有组氨酸标签的蛋白特异性结合到柱子里，其他的杂蛋白流出。Ni-NTA纯化介质是Ni离子金属螯合介质。
Ni柱中的氯化镍或者硫酸镍可以与有HIs()标签的碱性蛋白蛋白结合，组蛋白标签一般是6个组氨酸(碱性氨基酸)。在蛋白上样后，带有组氨酸标签的蛋白特异性结合到柱子里，其他的杂蛋白流出。Ni-NTA纯化介质是Ni离子金属螯合介质。
蛋白过镍柱纯化的原理：Ni柱中的氯化镍或者硫酸镍可以与有HIs(组蛋白)标签的碱性蛋结合，组蛋白标签一般是6个组氨酸(碱性氨基酸)。在蛋白上样后，带有组氨酸标签的蛋白特异性结合到柱子里，其他的杂蛋白流出。Ni柱中的氯化镍或者硫酸镍可以也可以与咪唑结合这时候再用咪唑洗脱，梯度洗脱，咪唑竞争性结合到硫酸镍上，目的蛋白就被洗脱了，这时候收集浸出液，那么里面就是你要的目的蛋白，然后透析掉咪唑就行了。现在的柱子大多是预装柱，也就是不用自己填柱，就是装好镍的傻瓜柱，也不贵，上样，洗脱，基本两个步骤就结束了。剩下的看你怎么处理了。
高亲和Ni-NTA纯化介质(L00250)是把螯合剂(氮川三乙酸或NTA)共价偶联到琼脂糖介质(4%交联)上，然后再螯合Ni2+制备而成。NTA能够通过四个位点牢固的螯合Ni2+从而减少纯化过程中Ni2+泄露到蛋白样品中。Ni-NTA纯化介质可以纯化任何(原核，酵母，昆虫细胞和哺乳动物细胞等表达系统)表达的天然或变性的His-标签蛋白。结合在介质上的蛋白可以通过低pH缓冲液、咪唑溶液甚至组氨酸溶液洗脱下来。
一、NI-NTA提纯操作步骤
1. 试剂和耗材准备：
Bind BWash BElution B柱子;填料;等。
pET.wap.ns②A1; PET21空; 200ml诱导表达菌液;
2.1 50ml灭菌收集菌液，用冰冷10ml PBS清洗菌液1次，离心
2.2 重悬8ml bind buffer ，冰上超声破碎，10s间隔，至菌液不在粘稠，分装至EP管，
2.3 4℃ 14000r/min 20min，分离上清，沉淀用5ml Buffer A+DTT重悬
2.5混匀50%NI-NTA，吸2ml 50%NI-NTA ，上柱(做2个柱，1ml NI-NTA/柱)，待完全沉淀(约1h)，先用10ml灭菌水洗，流速：重力作用
2.6 10ml 1*Bind Buffer 进行平衡，流速：重力作用
2.7 将准备好的样品上样，pET.wap. PET21 only分别上柱(结合时间1h-1.5h流速控制在0.1ml/min左右， EP 管，分管收集上样后液体)
2.8 10ml 1* Bind Buffer 洗柱子(收集洗脱液10管，流速在0.3-0.4ml/min左右)
2.9 10ml 1*Wash Buffer洗柱子(收集洗脱液10管，流速在0.3-0.4ml/min左右)
2.10 5ml 1* Elution Buffer洗柱子(收集洗脱液5管)
2.11 用15ml 0.5m NaoH清洗，时间约0.5-1h(0.5ml/min)
2.12 用20%乙醇清洗，约0.5-1h(0.5ml/min)
2.13 封好加样口，柱子存放4℃备用
洗脱液-80保藏
试剂配方：
10&NI-NTA Bind Buffer (天然条件Binding/Lysis Buffer，100mL)
50mM NaH2PO4 7.8g NaH2PO4&2H2O(MW 156.01g/mol)
300mM NaCl 17.53g NaCl(MW58.44g/mol)
10mM imidazole 0.68g咪唑(MW68.08g/mol)
NaOH调整PH至8.0，滤膜过滤
10&NI-NTA Wash Buffer (天然条件Wash Buffer，100m L )
50mM NaH2PO4 7.8g NaH2PO4&2H2O (MW 156.01g/mol)
300mM NaCl 17.53g NaCl(MW58.44g/mol)
20mM imidazole 1.36g咪唑(MW68.08g/mol)
NaOH调整PH至8.0，滤膜过滤
10&NI-NTA Elution Buffer(天然条件Elution Buffer.，100m L)
50mM NaH2PO4 7.8g NaH2PO4&2H2O (MW 156.01g/mol)
300mM NaCl 17.53g NaCl(MW58.44g/mol)
250mM imidazole 17.0g咪唑(MW68.08g/mol)
NaOH调整PH至8.0，滤膜过滤
(0.1M PBS, pH 7.4):
137mM NaCl(MW58.44g/mol) --------------------------------------------- 8g
2.7mMKCl(MW74.55g/mol)----------------------------------------------- 0.2g
10mMNa2HPO4 (anhydrous) (MW141.98g/mol)----------------------- 1.42 g
2mMKH2PO4 (anhydrous) (MW136.09g/mol) ------------------------- 0.27g
Distilled water ----------------------------------------------------------- 1000 ml
Mix to dissolve and adjust pH to 7.4( HCl ,调节)
高压灭菌后，Store this solution at room temperature. Dilute 1:10 with distilled water before use and adjust pH if necessary.
二、Ni-NTA 常见问题及建议
纯化的组分中没有His 标签的?
首先确定是蛋白没有挂上柱还是蛋白没有被洗脱下来。若His 标签蛋白没有与柱结合：
可能原因：超声的功率不对( 太大，蛋白炭化，太小，蛋白没有释放)
策略：改变超声功率，并在超声前加入溶菌酶
可能原因：样品或者是结合缓冲液不正确：
策略：检测pH 及样品和结合缓冲液的组成份。确保在溶液中鳌合剂或强还原剂的浓度及咪唑的浓度不是太高。
可能原因：组氨酸标签暴露不完全
策略：在变性条件下( 用4-8 M 脲，或4-6 M 盐酸胍) 进行纯化。
可能原因：His 标签丢失
策略1：WB 检查His 是否表达，上游构建，改变His-tag 的位置(C- 端或 N- 端)，必要时增加His 个数。
策略2：孵育的时间不够，降低流速和增加孵育的时间。
策略3：改变螯合的金属离子，寻找到最佳的结合金属离子。
Ni2+ 通常是从宿主细胞蛋白中纯化大多数6&His 标记的重组蛋白质的首选金属离子。也是一般最常用的离子。蛋白和金属离子之间的结合强度受几种因素影响，包括长度、位置、亲和标记在蛋白的暴露程度、所用离子的类型、以及缓冲液的pH，因此一些蛋白用其他离子可能更容易地进行纯化而不用Ni2+。
His 标签蛋白若没有洗脱下来，请依次检查：
可能原因：洗脱条件太温和(组氨酸标记的蛋白质仍然结合在柱上，结合力较强)
策略：用增加咪唑的梯度洗脱或降低pH 来找出最佳的洗脱条件。
可能原因：降低pH 的方法洗脱的，因为若pH 低于3.5，会导致镍离子脱落
策略：改变洗脱办法，咪唑竞争性洗脱
可能原因：蛋白已沉淀在柱上
策略：减少上样量，或使用咪唑的线性梯度而不是分步洗脱以降低蛋白的浓度。试用去污剂或改变NaCl 的浓度，或在变性条件( 去折叠) 下洗脱( 用4-8 M 脲，或4-6 M 盐酸胍)。
可能原因：非特异性疏水或其他相互反应
策略：加非离子去污剂到洗脱缓冲液(如：2% Triton X-100)或增加NaCl 的浓度。
His 标签蛋白洗脱后杂带较多，什么原因? 如何优化?
高纯度的蛋白是纯化工作者的追求，但是由于很多天然的蛋白也会带有HIS，所以经常会出现HIS 标签蛋白洗脱后有一些杂带，可能的原因和优化的方法如下：
可能原因：蛋白酶部分降解了标签蛋白
策略：请添加蛋白酶抑制剂。
可能原因：杂质对镍离子有更高的亲和性
策略1：咪唑浓度必须优化，以确保高纯度( 宿主细胞蛋白质的低结合) 和高产率( 组氨酸标记的目标蛋白质的强结合) 之间的最佳平衡。分步或者线性洗脱摸索出最优的咪唑结合和清洗浓度;在样品中加入与结合缓冲液同样浓度的咪唑;咪唑的梯度不大(20 个或更多的柱床体积)，可能分离出有相似结合强度的蛋白
策略2：筛选最适合的缓冲液条件，NaCl 浓度，pH 的范围都需要进行筛选。对于单一目标蛋白在进行缓冲液筛选时，将缓冲液、盐、甘油和还原剂设计成不同的混合配方来进行优化。
策略3：若以上优化的条件都不能去除杂质蛋白，需要考虑多步纯化的思路，如利用Strep 标签进行两步纯化或采用Subtractive method 进行纯化。
可能原因：杂质和标签蛋白结合在一起
策略：在超声破碎细胞之前加入去垢剂或者还原剂;增加去垢剂的浓度( 2% Triton X-100 or 2% Tween 20);或者在Wash buffer 中增加甘油的浓度(50%) 减少非特异性的相互反应;考虑增加咪唑的浓度或者改变金属离子。
可能原因：洗涤不充分
策略：增加洗涤的次数，使洗涤充分。
蛋白过镍柱纯化步骤中，因为现在很多都是预装柱，也就不用自己装填料了，一般的蛋白纯化也就只有上样和洗脱两个步骤了。需要注意的是纯化过程中流速不应该过快。
作者：青岚 点击：次
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&镍柱重生后与原先颜色不同
镍柱重生后与原先颜色不同
作者 mtf_victor
实验室使用的是散装的Ni-NTA beads（Qiagen），没有重生过的Beads的颜色是“天蓝色”。
使用几次之后，我就进行了beads的重生，重生后呈现“浅绿色”。
但实验室的其他人用相同的方法重生他自己使用后的beads，却可以呈“天蓝色”。
不知道是什么原因，特来询问有经验的人。
重生的方法：
（使用后的beads，浸泡在25%酒精里保存，以备重生。）
1） 5倍柱体积（Column Volume，CV）水洗涤。
2） 2倍EDTA洗去Ni。（柱子呈白色，略黄）
3） 5 CV水洗涤。
4） 0.5 M NaOH 洗涤2CV，浸泡30 min.
5)& &5 CV水洗涤。
6)& &0.1 M NiSO4 洗涤2 CV，浸泡过夜。
7） 5 CV水洗涤。
8)& &2 CV 20% 酒精洗涤，并浸泡保存。
我考虑可能的原因有以下这么几个：
1. 纯化蛋白的过程中，使柱子吸附了某种色素，且该色素在上述重生过程中没有除去。（而其他人纯化的蛋白可能不含这种色素）
2. beads使用时间过长（不是新beads）或者保存、使用不当，导致Ni离子螯合能力下降，使beads只能呈现绿色。
那么问题来了，
beads螯合能力下降会导致这种颜色的变化吗？不是蓝色变浅，而是变成绿色？
会不会有其他原因导致这种变化？
颜色的变化是beads的结合能力的反应吗？
有没有处理方法使beads变回原来的颜色？
谢谢，我是新手，请大家不吝赐教！
使用500mM的 imidazole洗一下看看
补充一下，就是我再生过的beads，不脱镍，用0.5 M NaOH洗的话，会在几分钟内变成褐色，别人的就不会。
有人说变褐色是因为Ni(OH)2沉淀，但是Ni(OH)2沉淀的颜色不应该是白色的吗？
请大家一并诊治。
建议在EDTA去镍之前，用盐酸胍和8M尿素、500mM咪唑先后冲洗，然后用2%的SDS冲洗，接着用5%到25%的酒精梯度冲洗。（当然每两步之间步都要用蒸馏水冲洗）
另建议在使用之前，用500mM的 imidazole冲洗后再使用（柱子颜色会有变化哟），
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先前已经提到 Strep-tag(R)的历史（点此回顾），现在我们将着重介绍 Strep-tag(R)在哺乳类细胞表达系统的应用。
虽然大肠杆菌 E.coli 表达系统经济实惠，但由于缺乏重要的脂类，分子螫合物，以及重要的翻译后修饰，用它表达真核蛋白，可能会影响蛋白本身的折叠及功能，以膜蛋白为例，大肠杆菌表达系统能影响目标蛋白在细胞膜的插入位置、及其应有的功能[1]。除此之外，当目标蛋白大于 50kDa 时，使用大肠杆菌系统可能表达出不完整的蛋白[2]。
所以，为了研究特定蛋白的功能（如：信号通路）、生产较大型的蛋白，或进行高解析度的结构分析，愈来愈多的实验组选择哺乳类表达系统来生产融合蛋白。其原因为哺乳动物细胞生产出的重组蛋白与人类蛋白十分相似，有较完整的蛋白折叠、组合及翻译后修饰[3]。因此，愈来愈多科学家们更加关注于--如何从哺乳类细胞中高效的纯化目标蛋白。
亲和标签的选择
首先，需考虑选择合适的亲和标签。常用于哺乳动物表达系统的亲和标签有 His-tag、FLAG-tag、GST-tag及 Strep-tag(R)等[4-12]，整理于下表：
这些亲和标签在使用上各有千秋。
使用 His-tag 时，常遇到的问题是寄主蛋白与填料的非特异性结合，在哺乳动物重组蛋白的纯化过程中，这样的情况更为明显。由于系统中有很多含有组氨酸（histidine）的残基的蛋白，这种蛋白结构与 his-tag 相似，容易与镍柱结合，因此导致目标蛋白纯度降低[13]。
FLAG-tag 系统可在非变性条件下进行纯化，能得到高纯度、有活性的蛋白，但其缺点为纯化介质较为不稳定，且纯化成本高上许多[5]。
另一常用的标签为 GST-tag，一个 26kDa 的蛋白，其特点是表达量高，具高度抗原性，常用来增加目标蛋白的溶解度，但常常会影响目标蛋白的特性，一般推荐纯化后将标签去除[8]。
而 Strep-tag(R)（包含 Strep-tag(R)II或是 Twin-Strep-tag(R)），都是短肽标签，分别为 8 或 28 个胺基酸，一般不干扰蛋白折叠或活性，因此适合用于蛋白功能性研究[5]。Strep-tag(R)可以特异性的结合在 Strep-Tactin(R)(二代介质) 或 Strep-Tactin(R)XT (三代介质) 的生物素的结合位点。洗脱时使用的脱硫生物素（适用于二代）或生物素（三代），对同样的结合位点有更高的亲和力，能将目标蛋白从同样位置移除，因此得到的目标蛋白纯度一般高于 95%[12]。
同时，三代 Strep-Tactin(R)XT 与 Strep-tag(R)蛋白的亲和力大幅提升，直接加入含目标蛋白的哺乳细胞的培养上清，即可高效纯化出所需蛋白（注: 原本使用二代需先以 Avidin 或是 BioLock 将培养基中的生物素遮蔽，才不会影响纯化表现）。
三代 Strep-Tactin(R)XT 亲和力显著
图 A 比较了 His-tag 与 Strep-tag(R)直接加入哺乳细胞培养上清纯化目标蛋白的表现。
图 A：分别向 Strep-Tactin(R)XT High Capacity 1ml 重力柱（左）和 Ni-NTA 1ml 重力柱（右）中，同时加入含 4mg mCherry-Twin-Strep-tag (TST) 或 mCherry-His-tag (His) 萤光蛋白的 ExpiCHO 细胞培养上清（注: 接下来的实验皆是取哺乳细胞表达某抗体后的上清，另加入高纯度目标蛋白进行实验)。由图可见，Strep-Tactin(R)XT（左）能高效率的捕捉 mCherry-TST，而右方的 mCherry-His 几乎无法挂柱。
此外，我们也测试了其他的蛋白，例如 SEAP (72 kDa) 或抗体 (mAb，其重链为 55 kDa)。图 B 为以 Strep-Tactin(R)XT纯化 SEAP-TST、mCherry-TST与 mAb-TST 的 SDS-PAGE 分析结果，可见对于不同蛋白，Strep-tag(R) 系统都能纯化出高纯度的目标蛋白。(注: 红色标记处为 mCherry 的降解产物，非杂带)
因 Strep-Tactin(R)XT与 Twin-Strep-tag 蛋白的高亲和力，即使目标蛋白的浓度低，使用 Strep-Tactin(R)XT仍可以有效的捕捉上清中的目标蛋白。表 C 整理了几个实验的数据，显示当目标蛋白浓度低于 20 μl/ml 时，得率仍能达到几近 100%。
Strep-Tactin(R)XT 普适性高
除了上述实验所用的 CHO 细胞株外（中国仓鼠卵巢细胞），另一常用于生产蛋白的哺乳动物细胞株为 HEK293(人胚胎肾细胞)，使用上较 CHO 简单。我们测试了 Strep-Tactin(R)XT 的纯化表现 : 表 D1 为以 Expi293 表达 SEAP-TST 或 mCherry-TST 蛋白后，目标蛋白的浓度。图 D2 为纯化表现的 SDS-PAGE 分析。从中可知，与 ExpiCHO 培养基相同，直接将表达好的 Expi293 上清加入 1 ml Strep-Tactin(R)XT 高载量重力柱中进行纯化，一样能够快速的得到高纯度的目标蛋白。
综上所述，Strep-tag(R)非常适合用在哺乳动物细胞系中表达目标蛋白，其纯化过程也与常见的 ExpiCHO 及 Expi293 培养基相容，不须另外处理，让实验流程更为便利。加上 Strep-tag(R)系统在纯度上的优势，是目前在这个应用上的绝佳选择。
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