木霉菌REMI突变株构建及其功能挖掘--《湖南农业大学》2007年博士论文
木霉菌REMI突变株构建及其功能挖掘
【摘要】：
木霉菌是传统的植物病害生物防治真菌,然而随着生态农业的快速发展,木霉菌的单一功能很难满足农业清洁生产多方面的需求,因此筛选出具有更多生态功能的木霉菌具有重要意义。除了防病功能外,本研究针对目前生态农业中对农作物秸秆处理、土壤磷化合物的降解、杂草的抑制等需求,通过限制性内切酶介导的基因整合技术(restriction enzyme mediated DNA integration,REMI)对野生型木霉菌进行分子改良,以求获得多功能木霉菌资源,为进一步创制新型木霉菌剂奠定基础。
两株木霉菌T.atroviride T23和T.koningii CICC 40144经过REMI转化,共得到201株突变株,并继代培养、PCR检测和Southern杂交,证明外源质粒pV_2已经成功整合到出发菌基因组中,且单拷贝率达64.3%,形成了优化的木霉菌分子改良技术体系,为今后克隆功能基因奠定了重要基础。对不同条件下REMI突变株菌丝生长及产孢的情况进行了研究,发现这些突变株在pH2-10范围内均可生长,pH在4-6时,菌丝生长最快;30℃时菌丝的产量最高;液体培养基中以蔗糖和果糖为碳源,以酵母膏、蛋白胨为氮源时突变株的菌丝生长最好,菌丝干重最大。总体上看,经过转化之后获得的突变株在利用碳源、氮源方面比出发菌T23有了明显的提高。对不同条件下突变株孢子萌发的情况进行了研究,发现在15℃-40℃时突变株孢子均可萌发,但最适温度为25℃-35℃;培养28h各突变株孢子萌发率均达到100%;孢子萌发pH值范围为2-8,在pH10时几乎不萌发;光照可以促使孢子萌发,湿度越大,孢子萌发率越高。当湿度为100%时,突变株TE7的孢子萌发率最高,几乎达到100%。
用聚丙烯酰胺凝胶电泳技术对木霉菌T23及其4株突变株的可溶性蛋白和酯酶进行了比较。研究发现各突变株之间,突变株与出发菌之间可溶性蛋白和酯酶的谱带均有差异。4株突变株在不同程度上均存在着蛋白条带的丢失现象,其中突变株TE7丢失了5条蛋白带;酯酶同工酶之间的差异更为明显,且谱带数量也明显少于可溶性蛋白谱带。这些结果说明外源质粒DNA插入木霉菌染色体之后导致基因组结构发生改变,从而引起了由基因组控制的蛋白的改变,此研究为今后进一步定位和克隆基因奠定理论基础。
为了对木霉菌株更多功能的挖掘,通过筛选获得了纤维素酶活明显高于出发菌的的突变株11株(TK-2R-3、TK-2R-9、TK-2R-11、TK-2R-14、T30-B3、T30-C7、T23-A2H等),且出发菌纤维素酶活越高,其突变株纤维素酶活提高幅度越小。最终获得了一株高产纤维素酶木霉突变株TK-2R-14,其CMC酶活达37.6IU/mL,比出发菌提高8.05%,FPA酶活达16.9 IU/mL,比出发菌提高19.01%。通过正交试验确定了突变株TK-2R-14固体发酵时最佳培养基组分为稻草粉:麦麸为9:1,料水比1:1,硫酸铵1%,Tween-20 0.1%;通过单因素优化试验,确定其最佳培养条件为:接种量5%-7.5%,培养温度30℃,培养时间96h,pH值自然,该突变株的FPA酶活和CMC酶活分别达6.097 IU/g、8.123 IU/g。
从康氏木霉T30的REMI突变株中筛选到四株解磷能力较强的突变株TK-2、TK-38、TK-46、TK-47,以TK-46最显著,其解磷能力比出发菌提高41%,达363.79μg/mL。对突变株TK-46的解磷条件进行了研究,发现其在以麦芽糖为碳源、氯化铵或硫酸铵为氮源、pH7.0的条件下,解磷作用最好,且对CaHPO_4的溶解能力远大于AlPO_4,但不能溶解FePO_4。同时发现pH值下降并不一定引起解磷,但解磷可导致pH值下降。
从木霉菌REMI突变株中,筛选出了8株有抑草活性突变株TA2,TB3,TB7,TE2,TE5,TH8,TJ6和TJ9,并对水稻生长安全。在对发酵液分离后进一步检测发现,无论是孢子液、孢子超声波破碎液还是去除孢子的发酵液对稗草根的抑制作用均优于苗;且对苗的抑制作用主要表现为完整的孢子,破碎的孢子对苗基本没有抑制作用,去除孢子的发酵液对苗的抑制作用也不明显。另外还发现,突变株TE2的抑草活性是由存在于发酵液中的某些次生代谢物产生的,与分生孢子无关;但突变株TH8的抑草活性刚好相反,其抑草活性由分生孢子产生,而与其代谢产物无关。最后筛选获得了一株抑草活性较强且功能较全面的目标菌株TB3。对筛选出来的抑草活性较高的木霉REMI突变株TB3的抑草素活性组分进行了分析,通过萃取及蛋白沉淀等方法分离出突变株发酵液的不同组分,然后进行抑草活性检测,结果发现该突变株TB3所产生的这种抑草活性物质即不是胶霉毒素,也不是二氢绿胶霉素,可能是一种蛋白质,该蛋白质用丙酮沉淀会失去其活性,但用硫酸铵沉淀活性保存完好,且适应于用高饱和度硫酸铵沉淀。该蛋白质究竟是一种什么样的蛋白,需进一步研究。
为了阐明木霉突变株表型改变的本质,采用功能蛋白质组学的差异蛋白分析方法,比较了突变株TK-2R-1与出发菌T.koningii CICC 40144之间的蛋白质差异,在2-D电泳图谱中获得了8个蛋白表达量存在差异的蛋白点,经质谱分析,鉴定出了4个蛋白点,这些蛋白点均与木霉的生长代谢有关。利用质粒拯救技术研究了突变株TB3和TK-2R-1、TK-2R-14、TK-2R-15插入位点分子特性,得到了经REMI突变后限制性内切酶插入位点侧翼的序列,但是在Blast数据库中基本没有找到与之相对应的功能基因序列,故猜测其可能是一些未知的氨基酸序列,这些序列经ORF Finder查找,没有找到足以大到编码一种蛋白质的ORF,这些序列的作用还有待进一步研究。
【关键词】：
【学位授予单位】：湖南农业大学【学位级别】：博士【学位授予年份】：2007【分类号】：S476【目录】：
Abstract7-15
1 木霉菌株的分子改良技术15-26
1.1 传统改良技术15-19
1.2 木霉菌突变株构建新方法--插入突变技术19-26
2 木霉菌功能研究现状26-45
2.1 木霉菌的生物防治功能研究进展26-28
2.2 木霉菌对植物生长的促进作用28-30
2.3 木霉菌对植物生长的抑制作用----抑草作用30-32
2.4 木霉菌生物修复功能研究进展32-34
2.5 木霉菌解磷作用研究进展34-39
2.6 木霉的生物降解功能39-45
3 选题依据及本研究的主要内容45-47
第一章 木霉REMI突变株的构建与检测47-61
1 材料与方法47-53
1.1 材料47-50
1.2 方法50-53
2 结果分析53-58
2.1 原生质体制备与再生53-54
2.2 质粒提取与检测54-55
2.3 突变株筛选与培养性状观察55-56
2.4 突变株PCR检测56-57
2.5 Southern blot57-58
3 讨论58-60
第二章 木霉菌突变株生物学特性研究61-82
第一节 不同条件下木霉菌突变株生长性状变化61-73
1 材料与方法61-63
1.1 材料61
1.2 方法61-63
2 结果与分析63-70
2.1 培养条件对突变株菌丝生长及产孢的影响63-67
2.2 不同培养条件对突变株孢子萌发的影响67-70
3 讨论70-72
3.1 木霉菌突变株的营养需求70-71
3.2 环境因素对木霉突变株生长的影响71-72
第二节 木霉菌突变株酯酶同工酶和可溶性蛋白的电泳分析73-82
1 材料与方法73-76
1.1 材料73-75
1.2 方法75-76
2 结果与分析76-80
2.1 可溶性蛋白电泳分析76-79
2.2 酯酶同工酶电泳分析79-80
3 讨论80-81
3.1 可溶性蛋白电泳分析80
3.2 酯酶同工酶电泳分析80-81
第三章 木霉菌突变株筛选与功能分析82-125
第一节 高产纤维素酶REMI突变株的筛选与固体产酶条件研究82-96
1 材料和方法83-88
1.1 材料83-85
1.2 方法85-88
2 结果分析88-94
2.1 标准曲线的绘制88
2.2 高产纤维素酶木霉突变株的筛选88-90
2.3 固体产酶培养基的正交优化90-91
2.4 培养条件对产酶的影响91-94
3 讨论94-95
第二节 REMI突变株解磷优势菌的筛选与解磷能力研究96-106
1 材料与方法96-99
1.1 材料96-97
1.2 方法97-99
2 结果与分析99-104
2.1 溶解磷酸盐突变株的筛选99-100
2.2 突变株对不同磷酸盐的溶解能力100
2.3 不同碳源对溶磷效果的影响100-101
2.4 不同氮源对溶磷效果的影响101-102
2.5 初始pH值对溶磷效果的影响102-103
2.6 突变株对不同剂量磷酸盐的持续解磷作用103-104
3 讨论104-105
小结105-106
第三节 木霉菌抑草活性突变株筛选106-114
1 材料与方法106-108
1.1 材料106-107
1.2 方法107-108
2 结果分析108-112
2.1 初筛试验108-110
2.2 复筛试验110-112
3 讨论112-113
小结113-114
第四节 木霉菌抑草优势菌株活性成分分析114-125
1 材料与方法114-117
1.1 材料114-115
1.2 方法115-117
2 结果分析117-123
2.1 高效液相色谱法检测结果117-121
2.2 萃取提取物抑草活性检测121-122
2.3 蛋白提取物抑草活性检测122-123
3 讨论123-124
小结124-125
第四章 REMI突变株分子特性的初步研究125-138
1 材料与方法125-130
1.1 材料125-127
1.2 方法127-130
2 结果与分析130-136
2.1 木霉双向电泳130-133
2.2 质粒拯救133-134
2.3 测序与blast分析134-136
3 讨论136-137
小结137-138
第五章 结论与创新点138-140
2 主要创新点138-140
参考文献140-156
附录156-159
致谢159-160
作者简历160-161
攻读博士学位期间发表的学术论文目录161-162
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京公网安备75号柑橘花粉染色体加倍与越南柑橘三倍体育种的研究--《南京林业大学》2011年博士论文
柑橘花粉染色体加倍与越南柑橘三倍体育种的研究
【摘要】：柑橘属于芸香科(Rutaceae)、柑橘亚科(Aurantioideae),是世界最重要的果树树种之一。柑橘因其芳香味美,营养价值高,深受大众喜爱。但只有无核或少核的三倍体类型的柑橘是一个优良性状,这无论对于鲜食还是加工都具有重要意义价值。因此,培育柑橘三倍体无核品种是目前柑橘育种的主要目标之一。在多倍体的育种中,2n配子的形成具有很重要的作用。2n配子是由于减数分裂过程中某些因素导致形成具有体细胞染色体数的花粉或卵细胞,常被称为未减数配子,2n配子在传递杂合性和上位性方面具有特殊价值,因而2n配子在植物多倍体育种中的研究应用逐渐升温。
福泽柚和演柚(Citrus grandis L. Osbeck)是越南的两个重要的地方品种,风味独特,品质优良,唯其果实中种子太多,严重影响其商品价值。因此,本文在观察2个柑橘品种的生物学特征和2n花粉自然发生情况基础上,以秋水仙素为诱变剂对福泽柚和演柚2n花粉诱导进行了初步研究,并取得了一定的进展。本试验主要研究结果如下：
(1)年连续两年,对福泽柚和演柚果实进行了观察。结果表明,福泽柚单果重指标数值均略高于演柚,但福泽柚的平均种子数高于演柚且皮厚,因此,演柚的可食率高于福泽柚；二者还有果实成熟期相差的特点,福泽柚的果实成熟期为9月中旬,演柚的果实成熟期为1月下旬。
(2)在红河平原地区,2010年福泽柚小孢子母细胞减数分裂开始于2月7日、演柚小孢子母细胞减数分裂开始于2月12日；当花蕾平均直径至0.3-0.4cm,小孢子母细胞减数分裂开始进入前期Ⅰ,4d左右减数分裂进行到四分体,前期Ⅰ持续时间较长。福泽柚和演柚的不同植株、不同花枝、不同花芽甚至不同花药的减数分裂进程都存在一定程度的差异,体现不同步性。
(3)采用不同浓度秋水仙素对福泽柚和演柚处于减数分裂前期Ⅰ的花蕾进行诱导,并成功的诱导出了2n雄配子。其中,秋水仙素溶液的最佳处理浓度为0.3%、0.5%,持续处理为4d、6d,可获得12.35和10.01%的福泽柚和演柚2n花粉比率,最高的处理达17.17和12.17%。
(4)福泽柚和演柚1n与2n花粉授粉后在柱头上都能正常萌发,但与1n花粉相比,2n花粉萌发较迟、2n花粉管伸长速度较缓慢。2n花粉参与受精能力比1n花粉弱,2n花粉在受精时间上竞争不过1n花粉。
(5)本试验对所获得的小粒种子和瘪粒种子进行拯救培养,获得的26株福泽柚苗和324株演柚苗进行Partec倍性分析仪检测,有3株福泽柚三倍体、4株演柚三倍体(染色体数为2n=3x=27)和3株演柚四倍体(染色体数为2n=4x=36)
【关键词】：
【学位授予单位】：南京林业大学【学位级别】：博士【学位授予年份】：2011【分类号】：S666【目录】：
致谢3-4摘要4-5ABSTRACT5-13第一章:绪论13-39 1.1 问题的提出13-14 1.2 越南农业生产经济区域与柑橘育种简介14-18
1.2.1 越南农业生产经济区域14-15
1.2.2 越南柑橘生产与分布区域15-16
1.2.3 越南柑橘品种简介16-18 1.3 越南、中国和国际研究进展18-37
1.3.1 柑橘无核机理的研究18-22
1.3.1.1 柑橘雄性不育18-20
1.3.1.2 柑橘胚囊异常发育20-21
1.3.1.3 柑橘自交不亲合21
1.3.1.4 柑橘胚中途败育21
1.3.1.5 外界因素的影响21-22
1.3.2 柑橘多倍体产生的基本方法22-30
1.3.2.1 芽变选种和实生选种22-23
1.3.2.2 物理和化学方法23-24
1.3.2.3 有性杂交24-25
1.3.2.4 转基因技术25
1.3.2.5 胚乳培养和愈伤组织培养25-26
1.3.2.6 原生质体融合26-27
1.3.2.7 幼胚拯救和未成熟种子培养27-29
1.3.2.8 未减数配子29-30
1.3.3 多倍体的鉴定及其在育种上的应用30-32
1.3.3.1 多倍体的鉴定30-31
1.3.3.2 多倍体育种应用31-32
1.3.4 果树未减数配子的研究32-37
1.3.4.1 2n配子的鉴定32-33
1.3.4.2 2n配子的发生机制33
1.3.4.3 2n配子形成的遗传学机制33-34
1.3.4.4 2n配子的遗传效应34-35
1.3.4.5 2n配子在果树育种上的作用35-36
1.3.4.6 2n花粉的分离纯化与诱导2n配子的方法36-37 1.4 本研究的目的、内容和思路37-39第二章:福泽柚和演柚的生物学特性和品质性状39-47 2.1 试验材料与方法39-40
2.1.1 试验地概况39
2.1.2 试验材料39
2.1.3 试验方法39-40
2.1.3.1 树体调查39-40
2.1.3.2 开花物候期与花的形态观察40
2.1.3.3 果实品质分析40 2.2 结果与分析40-45
2.2.1 树体生长41
2.2.2 物候期41-42
2.2.3 花的形态特征与结果习性42-44
2.2.4 果实品质44-45 2.3 小结与讨论45-47第三章:福泽柚和演柚的花粉染色体加倍47-75 3.1 试验材料与方法47-50
3.1.1 试验材料47
3.1.2 试验方法47-50
3.1.2.1 花粉母细胞的减数分裂观察47
3.1.2.2 2n花粉产生的细胞学检测47
3.1.2.3 秋水仙素诱导2n花粉47-48
3.1.2.4 2n与1n花粉参与受精能力的比较48-49
3.1.2.5 2n花粉的应用效果及后代的鉴定49-50 3.2 结果与分析50-72
3.2.1 花粉母细胞减数分裂观察50-54
3.2.2 2n花粉产生的细胞学机理54
3.2.3 秋水仙素诱导2n花粉54-63
3.2.3.1 处理适宜时期55
3.2.3.2 2n花粉发生频率的估测值55-57
3.2.3.3 2n花粉粒发生频率与染色力测定57-58
3.2.3.4 花芽存活情况58-60
3.2.3.5 自花授粉座果情况60-63
3.2.4 2n与1n花粉参与受精能力的比较63-68
3.2.4.1 不同倍性花粉形态及大小比较63-64
3.2.4.2 不同倍性花粉离体萌发动态比较64-66
3.2.4.3 不同倍性花粉的活体萌发及花粉管发育比较66-67
3.2.4.4 用2n花粉授粉杂交的效果67-68
3.2.5 多倍体的鉴定68-72
3.2.5.1 形态学鉴定68-69
3.2.5.2 气孔鉴定69-71
3.2.5.3 细胞学鉴定71-72 3.3 小结与讨论72-75
3.3.1 诱导时期和诱导方法的选择72-73
3.3.2 2n花粉产生的细胞学机理73
3.3.3 2n配子染色体加倍在果树育种上的利用展望73-75第四章:主要结论及展望75-79 4.1 主要工作及结论75-76 4.2 未来研究重点展望76-79参考文献79-89附录89-98攻读博士学位期间发表的论文98-99详细摘要99-102ABSTRACT102-104
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