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地塞米松对ALI7ARDS大鼠的保护作用及对糖皮质激素受体表达的影响
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　　地塞米松对ALI7ARDS大鼠的保护作用及对糖皮质激素受体表达的影响
　　乔凯1，李宏云1，杨闪闪1，贾宝辉2
　　1.郑州大学第五附属医院呼吸内科，郑州.南昌大学第四附属医院ICU，江西南昌330000
　　摘要：目的探讨小剂量地塞米松对急性呼吸窘迫综合征( ARDS)大鼠的保护作用及对糖皮质激素受体表达的影响。方法油酸复制ALI/ARDS大鼠模型。随机将18只SD大鼠分为三组：对照组(Al)、ARDS组(A2)、地塞米松组( A3)，每组6只。测各组大鼠动脉氧分压，肺组织病理切片，ELISA法测各组大鼠血液中TNF -d，免疫组化法测肺组织NF - KBp65，荧光定量RCR测各组糖皮质激素受体(GR)表达量。结果各组之间病理改变有明显差异，以下各指标：氧分压，TNF -仪，肺组织NF - KBp65含量，糖皮质激素受体(GR)表达量，各组之间差异均有统计学意义(P&0.05)。结论小剂量地塞米松对ARDS大鼠肺组织有保护作用，其作用机制可能与对糖皮质激素受体起到正向调节作用有关。
　　关键词：早期;小剂量;地塞米松;糖皮质激素受体
　　中图分类号：R - 332 文献标识码：A 文章编号：( 5-04
　　Protection of low dose dexamethasone on acuterespiratory distress syndrome rats and effecton glucocorticoid receptor expression
　　QIAO Kai' ,LI Hong - yun,YANG Shan - shan,JIA Bao - hui
　　Department of Respiratory, The Fifih Affiliated Hosptial of Zhengzhou University,Zhengzhou 450000,Chin.a
　　Abstract:Objective To investigate the protection of low dose dexamethasone on acute respiratory distress syndrome
　　(ARDS) rats and the effect on glucocorticoid receptor(GR) expression. Methods ALI/ARD rat model replication by
　　oleic zcid. Eighteen SD rats were divided into three groups randomly: the control group ( Al) ,ARDS group( A2) ,dxmgroup( A3) ,six rats in each group. Calculating arterial partial pressure of oxygen and make pulmonary tissue slices inevery group. Detecting concentration of the TNF - a in blood for every group by the method of ELISA. Detecting the ex-pression level of NF - KBp65 by immunohistochemistry and GR by PCR both in lung tissues. Results Obvious differ-ences exist in pathological changes among every group. There was little difference in pathological changes. Each index:arterial partial pressure of oxygen, TNF - a, NF - KBp65 and the expression of GR. Obvious differences exist amongthese three groups, (P & 0. 05). Conclusions There are protective effect about low dose dexamethasone on ARDS ratslung tissue. The positive regulation to GR may be the exact mechanism.
　　Key word:E L D Glucocorticoid receptor
　　多种原因可以导致肺等***的损伤，严重时可以引起急性肺损伤( acute lung injury，ALI)、急性呼吸窘迫综合症( acute respriratory distress syn-drome.ARDS)和多***功能障碍综合症(multipleorgan dysfunction syndrome, MODS)&&。在ALI/ARDS的发生发展中，系统性炎症反应综合征(sys-temic inflammatory response sysdrome,SIRS)起着重要的作用。SIRS的本质是机体释放过多的炎症介质与细胞因子，引起炎症失控和免疫紊乱，最终导致MODS，而肺脏往往是最先受累的***&2。纠。目前研究已证实无论是非感染因素或是感染因素H 3入侵机体后，机体均可产生炎性介质[ TNF -仪、TNF -B;11 -1、2、6、8、12]及细胞间黏附分子(ICAM)，在肺部的表现为肺泡膜及肺泡上皮损伤、毛细血管通透性增加、血小板聚集、微血栓形成、肺泡表面活性物质减少，进而形成ALI/ARDS。糖皮质激素以其非特异性抗炎作用在体内可抑制中性粒细胞和内皮细胞黏附，减少前炎症细胞因子合成，阻断细胞因子的释放，成为较为理想首选药物。但现实中对糖皮质激素治疗ALI/ARDS的疗效、治疗时机以及剂量的选择存在较大争议，本研究通过早期、小剂量地塞米松干预ALI/ARDS大鼠模型，探讨小剂量地塞米松对ALI/ARDS大鼠的保护作用及对糖皮质激素受体表达的影响。结果发现早期、小剂量地塞米松通过提高ALI/ARDS大鼠模型的糖皮质激素受体( GR)水平，起到对ALI/ARDS大鼠模型的保护作用，为今后对ALI/ARDS防治提供了实验依据。
　　1.材料与方法
　　1.1 实验动物与分组18只体重在250g~ 300g的健康雌性普通级大鼠(由南昌大学动物实验中心提供)，随机地分成对照组( Al)、ALI/ARDS组(A2)、小剂量地塞米松干预组(A3)。小剂量地塞米松组在制备模型同时腹腔注射地塞米松0. 3mg/kg[s]，对照组和ALI/ARDS组腹腔注射同等量的生理盐水。
　　1.2模型的制备严格按参考文献&6 3方法制备ALI/ARDS大鼠动物模型。术前禁食12h，腹腔注射20%的乌拉坦1g/kg麻醉后，经尾静脉注入油酸0. 15 ml/kg。对照组麻醉后，经尾静脉注入生理盐水0. Iml/kg。
　　1.3 主要试剂及仪器
　　1.3.1 主要试剂油酸500ml/瓶(北京市化工技术有限公司)，乌拉坦(山东齐鲁兴华制药有限公司)，肿瘤坏死因子- aELISA试剂盒购于北京奇松生物科技有限公司，NF - Kbp65免疫组化试剂盒购于武汉博士德生物工程有限公司，荧光定量RT - PCR试剂盒购于大连宝生物公司，GR引物购于上海生工生物有限公司。
　　1.3.2主要仪器洁净工作台(上海博迅实业有限公司医疗设备厂)，德国BS210S电子天平，OLYMPAS BX 41显微镜，HMIAS - 2000W高清晰病理图文分析系统，三阳超低温冰箱，湖南凯达台式高速大容量冷冻离心机，奥地利安图酶标仪，美国伯乐PCR仪。血气分析仪(瑞士型号：BW410PTICCA);微波炉型号(美的MM721AC8 -PW)等。
　　1.4检测指标
　　1.4.1肺组织病理学检查 模型制备成功12h后，经股动脉放血处死动物，剖胸取右下叶肺组织，经4%甲醛溶液固定，石蜡包埋切片，HE染色后在普通光学显微镜下观察病理改变。
　　1.4.2动脉氧分压分析模型制备成功12 h后，经颈动脉采集血样1.0 ml，应用血气分析仪测定动脉血氧分压( Pa02)。
　　1.4.3血浆TNF -仅浓度测定模型制备成功后12h，通过颈动脉抽血0.8ml，加入EDTA抗凝管;离心( 3000&g 4C) 15 min后，取上清保存于一70℃，待检。采用双抗体两步夹心酶联免疫吸附法测定。操作步骤及计算严格按试剂盒说明书进行。
　　1.4.4免疫组织化学Sp法检测肺组织中NF -KB P65蛋白表达动物处死后，取组织制备蜡块，切片，采用免疫组化sp法检测NF - KB P65蛋白表达水平。NF - KB P65抗体滴度均为1:100，二氨基联苯胺( DAB)显色，苏木精复染。结果判定标准：NF - KB P65阳性染色主要为胞核中见棕***颗粒为阳性。染色结果判定：根据细胞染色强度和染色细胞所占面积两者积分之和来判酬&，结果的判定由两位不知实验分组资料的病理医师进行。
　　1.4.5荧光定量PCR检测GR含量 模型制备成功12h后，取右肺上叶组织- 700C保存，标本中加入TRIZOL(Takara公司)1.Sml提取RNA，GR扩增引物序列：上游5 - TGCTCTGCTTTGCTCCT-GAT -3，下5- TCCCTTCCCTITTGAC - GATG -3;B - actin扩增引物序列：上游5- GCCCATCTATGAGGGTI'A -C-3，下游5- CTGGAAGGTGGACAGT-GAG -3。采用SYBR Green I染料法进行检测，PCR反应条件：反应体系25 Ul，95℃，30s;95℃，Ss;53℃，30s;600C，30s;反应结束由软件自动生成扩增曲线并设定基线，根据Livak等设计的一种比较阈值法来测定目的基因的相对表达，目的基因量=2一△△CT。由此可以准确地得到GR基因在ALI/ARDS组大鼠和小剂量地塞米松组大鼠肺组织的表达情况。
　　1.5统计学分析采用SPSS 11.5统计软件进行分析处理，资料以均数&标准差(元&s)表示，多组间比较采用单因素方差分析( one - way analysis ofvariance，ANOVA)，组间两两比较采用LSD -T检验，检验水准o
　　2.结果
　　2.1 病理学改变 大体观：ALI/ARDS组肺呈暗红色，可见水肿、出血，重量明显增加，切面大量液体渗出;对照组肺组织呈粉白色，表面无出血，切面无液体渗出;小剂量地塞米松组肺组织呈粉红色，表面无出血，切面有少量液体流出。镜下观：ALI/ARDS组可见肺泡间隔增宽，肺微血管充血、出血，肺间质和肺泡内可见炎细胞浸润及透明膜的形成;对照组肺组织结构完整，肺泡腔清晰，肺泡隔无水肿、炎症等特殊改变;小剂量地塞米松组肺泡腔及间质中渗出较ALI/ARDS组明显减少，无明显透明膜形成。三组病理结果如图1。
　　2.2 动脉氧分压 对照组氧分压为( 113. 17&4.355) mm Hg，ARDS组氧分压为(72. 67&18.907) mm Hg，小剂量地塞米松组氧分压为(106. 83&3.371) mm Hg。小剂量地塞米松组与ARDS组经方差分析，差异有统计学意义(P&0.05)。对照组10&40倍
　　2.3 血浆TNF -a浓度对照组血浆TNF -0【浓度为(5. 31 +1. 05) ng/L，ARDS组血浆TNF -0l浓度为(7. 58&0.92) ng/L，小剂量地塞米松组血浆TNF -仅浓度为(5.32&0.36) ng/L。小剂量地塞米松组与ARDS组比较，差异有统计学意义(P&0.05)o
　　2.4肺组织中NF - KB P65蛋白表达根据免疫组化阳性结果判定标准，对照组积分为(0. 33&0.21)，ARDS组积分为(2. 41 +0. 56)，小剂量地塞米松组积分为(1. 00 +0.18)，ARDS组与各组之间差异均有统学意义(P&0.05)。
　　2.5 各实验组大鼠GRmRNA表达比较 ARDS组GR基因mRNA平均表达量仅为对照组的33.40/0[8].表达量差异有统计学意义(P&0.05);小剂量地塞米松组GR基因mRNA平均表达量是 l：;对照组82. 50'，二者差异有统计学意义(P&0.05)。
　　表1各组大鼠肺组织CRmRNA表达的比较
&&&&B - actin
&&&&对照组
22. 34 t 0. 47 rJ
&&&&14. 66&0.57
&&&&ARDS组
24. 43 :t 0. 50a
&&&&15. &16士0.42
小剂量地塞米松组
23.2810.48h
&&&&15. 04士0.33
　　注：与对照组比较，ap& 0.05;与ARDS组比较，bP&0.05。
　　急性肺损伤( ALI)和急性呼吸窘迫综合征(ARDS)是指由心源性以外的各种肺内、外致病因素导致的急性、进行性呼吸衰竭。肺内炎性介质和抗炎介质的平衡失调，是ALI/ARDS发生、发展的关键环节H。，也是机体系统炎性反应综合征( SIRS)和代偿性抗炎反应综合征(CARS)平衡失调在肺部的表现。研究表明机体在SIRS时细胞内NF - KBp65活性及表达增加，NF - KBp65是一种位于细胞浆内，能够激活若干炎症反应、淋巴细胞分化及生长发育等基因转录过程的多功能异二聚体蛋白质&叫。目前国内外研究已经明确，编码TNF -仅、IL - 13、11-6和11-8等促炎因子的基因，是由核转录因子KBp65( nuclear factor - KBp65，NF - KBp65)控制表达的[10]。
　　近年来发现地塞米松具有抗感染性休克和抗炎效应，其机制可能在于抑制NF - KBp65的活化进而减少炎症介质的产生[11]。研究证实小剂量地塞米松在体外抑制LPS诱导的人单核细胞NF -KBp65活化和TNF -仅的产生而发挥抗炎作用，并且这种作用不随剂量的增加而增强[12]。糖皮质激素是机体在应激时分泌的重要内源性抗炎物质，其与细胞胞浆内的糖皮质激素受体( GR)结合形成激素受体复合物后，移位至核内与DNA结构基因上游的转录调节区域结合抑制活化的NF -KBp65介导的炎性因子的转录从而抑制炎性因子产生。但现实临床治疗中却并非如此，在SIRS发生发展中，由于GR蛋白合成减少，内源性GC的升高及GR***加速等原因，均出现GR的减少[13]和敏感性下降&14 - 15，从而发生SIRS和CARS平衡失调限制了糖皮质激素作用的发挥，基于此理论目前国内外对GC治疗ALI/ARDS的剂量选择主要集中在以下两个方面：①早期大剂量( &3~Smg/kg.d)冲击治疗，但易发生二重感染;水盐代谢紊乱和免疫抑制。②根据体内GR受体水平及功能不全程度选用不同剂量的糖皮质激素，这种方法由于受到对GR检测的限制而在实际临床工作不便于推广，往往错过了治疗最佳时期。在2004年败血症/感染性休克( sepsis/septic shock)治疗指南中建议应用较小剂量的糖皮质激素来治疗脓毒症/感染性休克，特别是体内存在相对性肾上腺皮质功能不全的危重病患者[16]。为本实验提供了理论依据。
　　本研究发现，早期小剂量地塞米松组大鼠肺组织病理切片大体观和镜下观较ALI/ARDS组有明显改善，血浆TNF -o【浓度、肺组织中NF - KBP65蛋白的表达均低于ARDS组，动脉氧分压、大鼠肺组织GRmRNA表达均高于ARDS组，以上差异均有统计学意义(P&0.05)，说明在ARDS的早期阶段应用小剂量的地塞米松一方面通过抑制NF - KBp65表达，从而调控体内炎症因子，减轻肺组织中的炎症反应，另一方面在不减少应激状态下体内GR水平的情况下相对提高体内GR水平，其机制可能与下调NF - KB P65蛋白的表达有关，NF - KB P65蛋白和GR之间的相关性则有待于进一步研究。
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