副溶血性弧菌标准的检验方法202
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一、检验方法
（一）操作步骤
1. 分离培养：首先称取样品25g，加225mL3.5％灭菌盐水，用均质器打碎或用乳钵磨碎，接种氯化钠琼脂平板和嗜盐性琼脂平板各一个，同时取10mL加入100mL增菌液中，放37℃8~16h培养后，涂上述平板进行分离，37℃培养18~24h取出观察，挑取可疑菌落，转种3.5％氯化钠三糖铁斜面，37℃、24h观察结果。
2. 涂片镜检：将三糖铁培养基上反应可疑者即底层变黄（葡萄糖产酸不产气）、上层斜面不变（乳糖、蔗糖不***）、有动力、不产生硫化氢，进行革兰氏染色镜检形态。
3. 嗜盐性试验：将上述可疑培养物分别接种不同含量的盐胨水（0％，3％，7％，10％）于37℃24h培养后观察生长情况，在无盐和10％盐的胨水中不生长，在3％和7％盐的胨水中生长良好者，继续进行下列有关试验。
4. 生化试验：分别接种下列各类生化培养基，葡萄糖、乳糖、蔗糖、甘露醇、甲基红、靛基质、V-P，赖氨酸、鸟氨酸、精氨酸、硫化氢及溶血性试验，放37℃培养，除V-P、靛基质和甲基红试验培养48h后加试剂观察外，其他均在24h观察结果。
5. 动物试验：将上述符合各类反应的副溶血性弧菌，接种3.5％氯化钠胨水，经37℃、16~18h培养后，小鼠腹腔注射0.3mL，观察2~3d，将死亡小鼠进行解剖作分离培养。
（二）检验程序
图6-1 副溶血性弧菌检验程序
二、结果分析判定及注意事项
（一）样品处理
采样时应注意首选准备好灭菌用具及容器，以无菌手续取有代表性的样品，样品必须尽快送检，不宜存放时间过长，副溶血性弧菌在适宜温度下繁殖较快，但不适于低温生存，在寒冷的情况下容易死亡，防止待检材料冷冻，以免影响检验结果。
对采取的样品有时因受存放条件的影响（如低温冷冻或干燥时间过长等原因），使菌体处于受伤状态，故需对此类可疑食品或可疑中毒材料进行增菌培养，但应注意为有利于细菌恢复，不宜选用抑制性较强的培养基，否则影响细菌生长。
样品经增菌8~16h后，转种平板进行分离，挑选可疑菌落，接种于含有3.5％盐的三糖铁培养基，此时挑选数目不应少于5个，尤其夏季海产食品混放，相互污染严重，时有不同型别的大量细菌存在，以防漏检。
（二）形态与染色
为革兰氏阴性无芽胞杆菌，易呈多形态，有棒状、弧状、卵圆状、球状、丝状等，排列不规则，多数散在，偶而有成对排列，一般大小为0.3~0.7ｕm&1~2ｕm，单端一根鞭毛，有动力，运动活泼，两端浓染，在固体培养条件下能生长周鞭毛。
（三）培养特性
在普通琼脂培养基和普通液体培养基中都可生长，在无盐的条件下不生长，在含2％~3％氯化钠的培养基中生长最旺盛，氯化钠溶液浓度到达10％以上时不繁殖。
在肉汤和胨水等液体培养基中混浊生长，需氧性强，常在液体表面形成菌膜，在液体培养条件下菌体多生长为单鞭毛，运行活泼。在固体培养基上，菌落常为隆起，圆形，稍混浊不透明，表面光滑，湿润，不产生色素。在比较新鲜湿润或软琼脂培养基上，有些副溶血性弧菌可形成不规则菌落或片状扩散生长，在0.7％以上琼脂的培养基上能生长周鞭毛（侧毛）。一般在20~25℃培养生长的周鞭毛较为稳定，而在37℃培养或24h以上的培养物，周鞭毛易于由菌体自发脱落，具有周鞭毛的菌株，在固体培养基上多表现扩散生长，单鞭毛的菌株在固体培养基上呈典型菌落，不表现扩散生长。
培养基的成分、种类、温度、湿度等条件的不同，都能对扩散生长有所影响，菌落形态也容易受条件的影响有所改变，如在嗜盐性平板上一般生长良好，而在SS琼脂平板上多呈较小的扁平菌落，不易挑起。在血平反上生长快可出现溶血环，在BCBS（硫代硫酸盐，柠檬酸盐，胆盐，蔗糖）和氯化钠蔗糖琼脂平板上，呈淡蓝或蓝绿色菌落。一般由腹泻病人初期分离者多为典型菌落，长期保存的细菌或条件不适宜时，常有菌落变粗糙，形状不整齐或菌落出现解离，有的在液体培养时呈沉淀生长现象。
pH生长范围为5~10，最适pH为7.2~8.2，发育最适温度为30~37℃。
（四）生化特性
本菌对葡萄糖产酸不产气，不***乳糖和蔗糖，能***甘露醇，产生靛基质，不产生硫化氢，甲基红阳性，V-P阴性，赖氨酸阳性，精氨酸阴性，鸟氨酸多数为阳性少数呈阴性，溶血性多数阳性，有少数不溶血，主要生物化学性状见表6-1。
近年来由于细菌学基础研究的深入和检验技术的进步，逐渐对一些海水来源的嗜盐性弧菌有所认识，对其主要生化学性状与副溶血性弧菌的比较见表6-2。
表6-1 副溶血性弧菌的主要生物化学性状
项 目 项 目
耐盐性0％ － 甲基红 ＋
7％ ＋ v ╟ p －
10％ － 靛基质 ＋
葡萄糖产酸 ＋ 赖氨酸 ＋
葡萄糖产气 － 鸟氨酸 ＋/－
蔗糖 － 精氨酸 －
甘露醇 ＋ 溶血性 ＋/－
硫化氢 －
注：＋阳性；－阴性；＋/－多数阳性，少数阴性。
表6-2 副溶血性弧菌与其他弧菌的鉴别
菌名 氧 化 酶 葡 萄 糖 产 气 赖 氨 酸 精 氨 酸 鸟 氨 酸 靛 基 质 明 胶 液 化 v ！ p 乳 糖 蔗 糖 甘 露 醇 肌 醇 阿 拉 伯 糖 甘 露 糖 鼠 李 糖 & 半乳 糖 苷 硝 酸 盐 泳 动 盐胨水，％
副溶血性弧菌 v.parahaemoly-ticus＋ － ＋ － ＋ ＋ ＋ － － － ＋ － d ＋ － － ＋ d － ＋ ＋ －
溶藻弧菌 v.alginolyicus ＋ － ＋ － ＋ ＋ ＋ ＋ － ＋ ＋ － － ＋ － － ＋ ＋ － ＋ ＋ d
o1霍乱弧菌 v.choleraeo1＋ － ＋ － ＋ ＋ ＋ d (d) ＋ ＋ － － ＋ － ＋ ＋ － d － －
非o1霍乱弧菌 v.cholerae nono1＋ － ＋ － ＋ ＋ ＋ d (d) ＋ ＋ － － d － ＋ ＋ d ＋ d － －
拟态弧菌 v.mimicus ＋ － ＋ － ＋ ＋ ＋ － (d) － ＋ － － ＋ － ＋ ＋ － ＋ d － －
河弧菌 v.fluialis ＋ d － ＋ － d ＋ － － ＋ ＋ － ＋ d d ＋ ＋ － ＋ ＋ d
创伤弧菌 v.ｖulnificus＋ － ＋ － ＋ ＋ ＋ － ＋ d d － － ＋ － ＋ ＋ － － d － －
梅氏弧菌 v.metschnikouii － － d ＋ － d ＋ ＋ d ＋ ＋ d － d － d － － － d － －
霍利斯弧菌 v.hollisae ＋ － － － － ＋ － － － － － － ＋ ＋ － － ＋ － － d － －
v.damsela － － d ＋ － － － ＋ － － － － － ＋ － － ＋ － － d － －
注：＋90％以上为阳性；－90％以上为阴性；（＋）迟缓阳性；d 11％~89％为阳性；（d）
11~89％迟缓阳性。
（五）溶血性试验
我妻氏用高盐血琼脂培养基，在限定的条件下培养副溶血性弧菌时出现的溶血反应，称此溶血性能为&神奈川现象&。
此试验要求是用人或兔的新鲜红血球制备高盐血平板，经37℃、24h培养，如在单个菌落周围呈现透明溶血环或在菌落下面有明显溶血者，为&神奈川现象&阳性，若不出现透明溶血环或无明显溶血者，为&神奈川现象&阴性。
有致病性的副溶血性弧菌，多数为神奈川现象阳性，但亦有少数为阴性。
（六）动物试验
经上述检验的可疑菌株，用小鼠测定毒力，将16~18h的蛋白胨水或肉汤培养物，注射小鼠腹腔0.3~0.5mL，有毒力者可在5~10h发病死亡，长者有24h左右发病死亡。发病时有竖毛、运动不活泼，腹部紧贴罐底，呼吸困难，四肢抽搐、尾部痉挛震颤等症状。将死亡小鼠解剖后，取心血等内脏进行分离，可检出试验菌的纯培养。对照动物观察2~3d无异常现象。
但应注意，尚有一些溶藻弧菌也可引起小鼠死亡，有时不易区别，需要上述毓的检验后，进行毒力证实，综合判定结果。
三、培养基
（一）氯化钠结晶紫增菌液
成分：蛋白胨 20g
氯化钠 40g
0.01％结晶紫溶液 5mL
蒸馏水 1000mL
pH9.0
制法：除结晶紫外其他按上述成分配好，加热溶解，约加3％氢氧化钾溶液4.5mL，校正pH，加热煮沸，过滤，再加入结晶紫溶液，混合分装试管，121℃高压灭菌15min。
（二）氯化钠蔗糖琼脂
成分：蛋白胨 10g
牛肉膏 10g
氯化钠 50g
蔗糖 10g
琼脂 18g
0.2％溴麝香草酚蓝溶液 20mL
蒸馏水 1000mL
pH7.8
制法：将牛肉膏、蛋白胨及氯化钠溶解于蒸馏水中，校正pH，加入琼脂，加热溶解，过滤，加入指示剂，分装烧瓶100mL，121℃高压灭菌15min备用。临用前在100mL培养基内加入蔗糖1g，加热溶化，冷至50℃倾注平板。
（三）嗜盐菌选择性培养基
成分：蛋白胨 20g
氯化钠 40g
琼脂 17g
0.01％结晶紫溶液 5mL
蒸馏水 1000mL
pH8.7
制法：除结晶紫和琼脂外，其他按上述成分配好，校正pH，加入琼脂，加热溶解，再加结晶紫溶液，分装烧瓶，每瓶100mL。
（四）3.5％氯化钠三糖铁琼脂
成分：蛋白胨 20g
牛肉膏 5g
乳糖 10g
蔗糖 10g
葡萄糖 1g
氯化钠 35g
硫酸亚铁铵 0.2g
硫代硫酸钠 0.2g
琼脂 12g
酚红 0.025g
蒸馏水 1000mL
pH7.4
制法：将除琼脂和酚红以外的各成分溶解于蒸馏水中，校正pH，加入琼脂，加热煮沸使琼脂溶化，加入0.2％酚红溶液12.5mL，摇匀，分装试管，121℃高压灭菌15min，放置高层斜面备用。
（五）氯化钠血琼脂（我妻氏培养基）
成分：酵母膏 3g
蛋白胨 10g
氯化钠 70g
磷酸氢二钠 5g
甘露醇 10g
结晶紫 0.001g
琼脂 15g
蒸馏水 1000mL
制法：调pH8.0，加热30min（不必高压），待冷至45℃左右时，加入新鲜人或兔血（5％~10％），混合均匀，倾注平皿。
（六）嗜盐性试验培养基
成分：蛋白胨 2g
氯化钠 按不同量加入
蒸馏水 100mL
pH7.7
（七）3.5％氯化钠生化试验培养基
成分：牛肉膏 5g
蛋白胨 10g
氯化钠 35g
磷酸氢二钠 2g
0.2％溴麝香草酚蓝溶液 12mL
蒸馏水 1000mL
pH7.7
制法：将上述成分配好后，根据所需的糖发酵管分别加入各种糖类，葡萄糖发酵管可按0.5％葡萄糖加入后，分装有小倒管的试管内，121℃高压灭菌15min。其他培养基可分装为每瓶100mL，121℃高压灭菌15min，另将各糖类分别配好10％溶液，同时高压灭菌后，取5mL糖液，加入100mL培养基内，以无菌操作分装小试管。
（八）葡萄糖食盐胨水（MR-VP试验用）
成分：多胨 5g
葡萄糖 5g
磷酸氢二钾 5g
氯化钠 30g
制法：加入1000mL蒸馏水，振摇加热，使全部溶解，冷却后分装小试管，121℃高压灭菌15min。
（九）食盐胨水（靛基质试验用）
成分：蛋白胨 20g
氯化钠 30g
蒸馏水 1000mL
pH7.4
制法：按上述分配制，分装小试管，121℃高压灭菌15min。
（十）运动性试验培养基
成分：牛肉膏 3g
蛋白胨 10g
氯化钠 30g
琼脂 4g
制法：将全部成分加入1000mL蒸馏水，加热溶解，分装试管，121℃15min高压灭菌，最终pH7.4。
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