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小鼠骨髓来源树突状细胞的体外扩增及鉴定
作者：孙 芸，
【关键词】& ,树突状细胞；骨髓细胞；混合淋巴反应
&&&&& 【摘要】& 目的& 体外诱导扩增小鼠骨髓来源树突状细胞（DC），并从形态、表面分子和功能三方面进行鉴定。方法& 无菌取骨髓细胞培养4h后，除去悬浮细胞，然后加入rmGM-CSF和rmIL-4培养，7天后观察DC的形态特征，流式细胞仪（FACS），检测DC表面分子及混合淋巴反应(MLR)，检测DC刺激同种异体T细胞增殖的能力。结果& 培养出的DC具有大小不一的突起，表达小鼠DC特异的表面标志33D1，及表面分子CD40、CD80和CD86；具有强烈刺激同种异体T细胞增殖的能力，且随DC数目的增多而增强。结论& 从小鼠骨髓细胞中扩增出大量具有典型特征的DC，为后续研究奠定基础。
&&& 【关键词】& 树突状细胞；骨髓细胞；混合淋巴反应
&&&& Amplification and identification of dendritic cells derived from mouse bone marrow in vitro
&&& SUN Yun,YANG Ji-yao,WU Jian-qing,et al.Life Scientific College of Nanjiang Normal University,Jiangsu 210097,China
&&& 【Abstract】& Objective& To induce and amply dendritic cells (DCs) from mouse bone marrow in vitro, and identify from their morphology，surface molecules and function. Methods& Isolated mouse bone marrow cells were cultured 4 hours, then removed suspended cells and added rmGM-CSF and rmIL-4.After 7 days, DCs morphological characterization was observed, the expression of the surface molecules was examined by fluorescent activated cell sorter(FACS), DCs’ power to stimulate the proliferation reaction of allogeneic T cells was detected with mixed lymphocytes reactivation(MLR).Results& Cultured DCs had longer oexpressed mouse special marker 33D1 and surface molecules including CD40,CD80,CD86;and intensely stimulated the proliferation of allogeneic T cells, What’s more, the power of proliferation was enhanced with the increase of numbers of DCs.Conclusion& Obtain a lot of DCs had typical characterization from mouse bone marrow, and establish foundation for further studies.
&&& 【Key words】& mixed lymphocytes reaction
&&& 树突状细胞（dendritic cell, DC）可以识别、摄取、加工和处理外来抗原，激活T细胞诱导机体初次免疫应答，调节T、B细胞介导的免疫应答和诱导对自身抗原的免疫耐受［1～3］。近年来，对DC的研究已经成为多种疾病免疫治疗的热点。为获得大量DC以满足实验的需要，本研究从小鼠骨髓细胞中定向诱导出具有典型形态、经表型和功能鉴定无误的DC，为基于DC的后续研究提供依据。
&&& 1& 材料
&&& 1.1& 动物& BALB/C小鼠，4～6周，雄性，购自中国科学院上海实验动物中心。ICR小鼠，6～8周，雄性，购自江苏省实验动物中心。
&&& 1.2& 主要试剂& 重组小鼠GM-CSF（rmGM-CSF）和重组小鼠IL-4（rmIL-4）（R＆D system）；FITC荧光标记的大鼠抗小鼠CD86、CD80、CD40单抗及抗小鼠的DC特异表面标志33D1单抗（eBioscience）；FITC荧光标记的山羊抗大鼠IgG单抗（北京中山生物公司）；伴刀豆球蛋白(ConA)（Sigma）；丝裂霉素C（Kaowa Hakko Kogyo）；CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay(MTS)试剂盒（Promega）。
&&& 2& 方法
&&& 2.1& 骨髓DC的分离培养& 参照文献方法［4］，略有改动。拉颈处死BALB/C小鼠，无菌剥离股骨和胫骨。用注射器将骨髓冲出，离心收集骨髓细胞，加入预温的0.83%Tris-NH4CL裂解红细胞，然后用含10%FCS的RPMI1640完全培养液调细胞浓度1×106/ml，接种于24孔培养板。置37℃,5%CO2的孵箱中培养4h后弃去悬浮细胞，并加入含rmGM-CSF（1000u/ml）和rmIL-4（500u/ml）的完全培养液。至第3天，更换含相同浓度细胞因子的完全培养液。至第5天，半量换液，并补足细胞因子。至第7天，轻轻吹打收集所有的悬浮细胞，即为体外扩增的小鼠骨髓来源的树突状细胞。每日用相差显微镜观察细胞的生长和形态变化。
&&& 2.2& DC表型检测& 收集培养至第7天的DC，调细胞浓度为2×105/ml，分别加入1μl FITC标记的大鼠抗小鼠的CD86、CD80、CD40单抗和大鼠抗小鼠的DC特异表面标志33D1单抗。设立空白对照。4℃避光反应30min。然后在加入DC特异表面标志33D1的管中再加入2μl FITC标记的山羊抗大鼠IgG，4℃避光反应30min。洗涤后上流式细胞仪检测。
&&& 2.3& 混合淋巴细胞反应（MLR）& 无菌取ICR小鼠的脾脏细胞过尼龙毛柱，得到的T细胞即为反应细胞，用终浓度为25μg/ml的丝裂霉素C处理DC作为刺激细胞，调细胞浓度为4×105/ml、刺激细胞与反应细胞按1:5、1:10、1:20、1:50的比例加入96孔板。每个3复孔，终体积为200μl。并设立ConA阳性对照、T细胞对照及空白对照。置于37℃，5%CO2孵箱继续培养96h。在培养结束前4h，每孔加入20μl MTS溶液。培养结束后用酶标仪读490nm时每个孔的吸光值。结果以3孔均值表示。
&&& 3& 结果
&&& 3.1& DC的生长情况& 培养4h后可见细胞体积小、圆形贴壁，均匀分布，第2天可以看到少量悬浮细胞，除去后可看到大量的点状细胞集落；至第4天可见细胞集落明显增多、增大。再继续培养可见细胞体积明显增大且形态不规则，有3～10个大小不等的毛刺状突起，呈现特征性的星状、树突状；至第7天，大量细胞从集落脱离、悬浮，但也有些稍微贴壁，轻轻吹打即可脱壁。
&&& 3.2& DC的表型& 流式细胞仪检测表明，培养的DC表达小鼠DC特异性的表面标志33D1，阳性率为53.64%，表达表面分子CD40、CD80和CD86，阳性率分别为71.34%、54.13%、61.67%。
&&& 3.3& 刺激同种异体T细胞增殖的能力& MLR显示DC能强烈诱导同种异体的T细胞增殖，且促增殖能力随着DC数目的增加而增强。在DC:T细胞比分为1:5、1:10、1:20、1:50时刺激能力（A490）分别为1.74、1.53、1.42和0.84。
&&& 4& 讨论
&&& 　　DC是目前发现的功能最强的专职抗原递呈细胞（APC），是体内唯一能激活初始T细胞反应的APC，在肿瘤、抗感染免疫、移植排斥等方面起着关键的引导和调节作用。DC广泛分布于血液、肝、脾脏、淋巴结及其他非免疫***组织中，但含量很少，在血液中仅占单个核细胞总数的0.5%～1.0%，难以与其他细胞分离纯化。直接从外周血或组织中分离不仅操作复杂，且细胞得率很低。因此，体外扩增DC是研究的必经之路。
&&& 　　自从Inaba［5］用rmGM-CSF体外诱导扩增小鼠骨髓DC以来，人们逐步建立并完善了多种培养扩增DC的方法。如从脐带血、外周血干细胞、外周血单核细胞中诱导分化出DC。尽管不同的前体细胞扩增DC的方法各不相同，但GM-CSF是必不可少的。它可以诱导DC前体增殖分化，并可在体外维持DC的存活。而IL-4可抑制粒细胞和巨噬细胞增生，有利于向DC分化。本研究用rmGM-CSF和rmIL-4这两种细胞因子诱导骨髓细胞定向分化成DC，同时根据DC和单核细胞粘附程度的不同，用手筛法除去悬浮细胞，既降低了成本，得到了足够用的DC，而且也保证了DC的纯度。
&&& 　　鉴定细胞是否为DC，一般根据形态学、组合型标志和刺激同种异体T细胞的增殖能力这三个方面来判断。除了具有许多树突样的突起这一典型特征外，其表面还表达CD40、CD86、CD80、ICAM等分子；能刺激初始T细胞的活化增殖，具有这些特征的细胞方能称为DC［6］。目前，有一些DC特异的表面标志已经得到公认［7］，如小鼠表面的33D1和NLDC145，大鼠的OX62及人DC表面的CD1a和CD83。本研究不但在显微镜下观察到细胞呈现大小不一的树突；同时采用了小鼠特异的表面标志33D1和CD80、CD86、CD40这三种DC表面分子作为标记物，其中CD80、CD86是为T细胞活化提供第二信号通路必须的共刺激分子；CD40可以与T细胞表面的受体结合，导致T细胞的活化。FACS检测显示培养的DC表达较高水平的33D1及3种表面分子，表明DC具有了刺激T细胞增殖的能力；而MLR则证实了DC的确可以强烈刺激同种异体的T淋巴细胞的增殖，并且刺激能力随着DC数目的增多而增强。综合这三方面，可以认定所培养出来的细胞正是DC。本研究从小鼠骨髓细胞中分化出大量DC，并且操作相对简便，为进行下一步研究奠定了基础。
&&& 【参考文献】
&&& 1& Palucka K. How dendritic cells and microbes interact to elicit or subvert protective immunone responses. Curr Opin Immunol, -431.
&&& 2& Banchereau J，Briere F，Caux C,et al. Immunobiology of dendritic cells. Annu Rev Immunol, -812.
&&& 3& Lutz MB. Immature, semi-mature and fully mature dendritic cells: which signals induce tolerance or immunity. Trends Immunol, -449.
&&& 4& 丁传林，姚，张天泰，等.IL-4对DC产生IL-12影响的研究.上海免疫学杂志, 8-251.
&&& 5& Inaba K, Inaba M, Romani N, et al. Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with grannulocyte/macrophage colony-stimulating factor. J Exp Med, : .
&&& 6& Steinman RM.The dendritic cell system and its role in immunogenicity. Annu Rev Immunol, -296.
&&& 7& Banchereau J,Steinman RM. Dendritic cells and the control of immunity. Nature, : 245-252.
&& 作者单位： 1 210097 江苏南京，南京师范大学生命科学学院
&&& 2 450052 河南郑州，郑州大学组织学与胚胎学教研室
&&& 3 210029 江苏南京，南京医科大学第一附属医院
　& (编辑：汪& 洋)
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