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类风湿关节炎的基因治疗
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类风湿关节炎的基因治疗
中华风湿病学杂志 2000年第5期第4卷 综述
作者：陈彤　杨虎天
单位：陈彤（200080 上海市第一人民医院中西医结合科）；杨虎天（200080 上海市第一人民医院中西医结合科）
　　类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，ra)目前尚没有令人满意的治疗。传统的治疗药物，其作用缺乏特异性，可产生很多毒副作用。ra的现代生物治疗，能够针对特异性的靶分子，给ra治疗开拓了新的途径。但是，绝大部分生物治疗需要高度纯化的蛋白质，价格昂贵；而且蛋白质口服活性差，在体内又会很快被清除，需要反复注射；另外，它们不能选择性地到达靶组织［1］。ra基因治疗至少在理论上有可能部分克服这些缺陷［2，3］。
　　1　ra基因治疗的候选分子
　　基因治疗是指为了治疗目的，将新的遗传物质导入机体细胞的疗法［4］。ra有别于经典的遗传性疾病，不是由单基因缺陷引起，而是很可能涉及了多个尚未阐明的易感基因以及环境因素，是复杂的遗传性疾病［5］。那么基因治疗如何才有可能在ra这样复杂的遗传性疾病治疗中占有一席之地呢?回答是：基因治疗在此不是修补天生的遗传缺陷，而是给予机体细胞新的功能。
　　从理论上讲，任何能抑制ra病理的分子都是基因治疗潜在的目标［2，3］。一般认为，ra可能是遗传易感者在未知的环境因素激发下，启动了由自身反应性t细胞介导的自身免疫反应，引起一系列炎症、免疫反应和关节滑膜的增生，最终导致了滑膜炎、关节破坏以及全身累及；而细胞因子等介质介导了这些反应［5］。所以，目前ra基因治疗的靶基因主要针对这些机制，特别是细胞因子，包括：①抗炎症、免疫反应的白细胞介素-1受体拮抗剂(il-1 receptor antagonist，il-lra)和可溶性肿瘤坏死因子受体(soluble tnf receptor，stnfr)和针对il-6的反义寡核苷酸［6－11］；②调节免疫反应的il-4、il-10、il-13、vil-10(virus il-10)、tgf-β、ifn-β［12－16］；③诱导细胞凋亡或抗滑膜增生的fasl、ap-1、增生细胞核抗原(pcna)、jund、c-myc、herpes胸腺嘧啶激酶(htk)、p16［ink4a］、galectin-1［17－19］；④促进组织再生的甲状旁腺激素［20］；⑤转录因子nf-κb［21］和信号传导分子细胞质酪氨酸激酶csk［22］。其他治疗基因包括黏附因子等免疫炎症介质［23］。
　　2　基因导入系统
　　当前基因治疗所面临的最大挑战，就是如何才能有效地将治疗基因导入细胞，按需要适当地表达。除了直接应用“裸”dna等外，基因治疗的困难是缺乏理想的运载治疗基因到达靶细胞使之表达的导入系统，即载体［4］。
　　基因导入系统可分为病毒和非病毒导入系统两大类，大部分导入系统应用载体。已研究过的载体有很多，各个载体都有各自的优缺点。病毒载体又可再分为rna、dna病毒载体。rna病毒载体主要应用逆转录病毒，逆转录病毒是目前基因治疗研究中最常用的载体。病毒载体主要的潜在缺点包括：①致病可能性；②免疫原性；③大规模生产的困难性。非病毒基因导入方法包括化学技术(如磷酸钙共沉淀)、机械技术(如微注射)、脂质体、裸dna、反义寡核苷酸、核糖酶、受体介导的dna导入等。脂质体是最常用的非病毒载体。尽管目前主要采用病毒导入系统，但是非病毒导入系统正受到更多的关注。主要的优点包括安全，容易大规模生产等。目前非病毒载体最大的缺点，是不能获得较高水平的基因导入和表达。最后，还有一些杂交的基因导入系统，如病毒和非病毒相结合的导入系统。
　　基因治疗又可根据基因导入方式分为体内和体外基因治疗。体内基因治疗是指将治疗基因直接注射到体内。体外基因治疗的一般过程为：①从患者获取适当的细胞，体外培养。②将治疗基因体外导入细胞。③筛选、增生表达治疗基因的细胞。④将细胞送回患者体内。体内基因治疗过程简便，但也存在不少问题，如载体在体内被稀释或结合，不能定向于特定的靶细胞，基因导入率低等；相对照，体外基因治疗能克服上述问题，且较为安全，但操作繁琐。
　　基因治疗还可根据导入途径分为局部或全身基因治疗。前者是将治疗基因直接导入病变部位，如受累关节；后者是将基因导入适当细胞(如肝细胞)，使表达产物能进入血液循环。采用局部还是全身基因治疗一定程度上取决于疾病，如系统性红斑狼疮累及很多脏器，就很可能需要全身基因治疗。但是，这并不绝对。此外，还有很多因素影响其选择，如选用的载体［2－4］。
表1　ra动物模型中的基因治疗
转导细胞/注射方式
逆转录病毒
aia、cia、scw、zia
滑膜纤维细胞、3t3细胞
逆转录病毒
stnfr、tgf-β、ifn-β
脾脏细胞、成纤维细胞
il-4、il-13、gal-1
cho细胞、成纤维细胞
cia、aia、兔关节炎
sil-1r、stnfr
胸腺嘧啶激酶
腺病毒相关病毒
β-半乳糖苷酶
仙台病毒-脂质体
识别nf-κb寡核苷酸
关节内、皮下
基质溶解酶
(反义)寡核苷酸
nf-κb、ap-1、pcna、
　　注：adjvant arthritis,佐剂关节炎
　　3　基因治疗在ra动物模型中的进展
　　ra主要累及关节，但一般累及多个关节，且可有全身表现，所以局部或全身基因治疗均已应用，见表1［2，3］。目前还不清楚哪一途径较好。
　　3.1　局部基因治疗：大部分ra动物实验采用了局部基因治疗。基因导入方式既有体内的，又有体外的。已研究的载体包括：①mulv逆转录病毒：在所有ra动物基因治疗中，小鼠白血病病毒(murine leukemia virus，mulv)是最常用的载体。由于逆转录病毒载体只转导分裂细胞，而大部分ra滑膜内细胞分裂并不活跃，所以主要采用体外基因治疗。应用兔膝关节作为模型，mulv载体可使导入的il-lra基因表达6周［6］。在兔抗原诱导关节炎(antigen-induced arthritis，aia)、大鼠链球菌细胞壁诱导关节炎(streptococcalcell wall-induced arthritis，scw)、小鼠酵母聚糖诱导关节炎(zymosan-induced arthritis，zia)和小鼠胶原诱导关节炎(collagen-induced arthritis，cia)模型中，由mulv载体将il-1ra cdna导入关节滑膜，有抗关节炎效应［8-10，24］。最近发展的高滴度载体，有望能直接注入关节进行体内基因治疗［25］。②慢病毒和腺病毒相关病毒(adeno-associated virus，aav)是另两个能整合到人染色体上的病毒。在动物实验，这两个病毒载体分别能够将治疗基因导入关节滑膜表达［24］。③腺病毒和单纯疱疹病毒(herpes simplex virus，hsv)载体都已被ra动物基因治疗采用，而且可以获得高水平的基因表达。但是，第一代的腺病毒载体会引起炎症，而hsv载体则有细胞毒性［26］。腺病毒载体主要用在体内基因治疗。在aia和cia中，分别将vil-10、sil-1ri、stnfrii基因由腺病毒载体导入受累关节，抗关节炎效应分别是强、中、弱，而同时导入sil-1ri和stnfrii基因，则有协同抗关节炎作用［10-27］。值得注意的发现是，治疗基因导入一个受累关节，抗关节炎效应能在另一个未导入基因的受累关节出现［28］。④脂质体：注射载有治疗基因的阳离子脂质体于兔膝关节，基因转导率很低，表达也短暂。但最近报道，应用中性的脂质体与仙台病毒结合的载体，可以使导入基因在关节滑膜较持续的表达。在scw中，将载有识别nf-κb寡核苷酸的脂质体注射到大鼠体内，有明显的抗关节炎效应［21］。⑤裸dna：已有报道，关节滑膜细胞能摄取和暂时表达裸dna。直接关节内注射编码il-10的质粒dna，能明显改善cia。
　　3.2　全身基因治疗：在ra动物研究中，体内和体外的全身基因治疗都已尝试。在体内全身基因治疗研究中，腺病毒载体是最常用的导入系统。静脉注射载有stnfri或vil-10基因的腺病毒载体，可改善小鼠cia，但出现肝脏毒性［29］。相对照，肌注质粒dna可能较为安全。已有报道，直接导入tgf-β cdna可改善scw［30］。
　　体外全身基因治疗选择适当的转导细胞非常关键，ra动物模型中已被研究的转导细胞包括造血干细胞、脾细胞等细胞系［2，3］。应用运载il-1a和stnfri的逆转录病毒为载体，体外转导小鼠造血干细胞，然后将转导后的细胞输入小鼠体内，发现转入的基因il-1a和stnfri可以较长时间、高水平地表达。初步研究结果显示，这些导入基因的小鼠，对内毒素有增强的抵抗力，但仍易感zia和aia。淋巴细胞也是吸引人的靶细胞，但应用目前的载体，转导有困难。
　　4　ra基因治疗的临床试验
　　1996年7月，ra第1例基因治疗临床试验在美国匹兹堡医学中心开始［31］。接受治疗的患者是一名68岁的绝经后妇女，患有严重的慢性、多发性关节炎，多个关节需要接受关节成型术。这是人类通过的第一个基因治疗方案，用来治疗一种通常不认为是致命的疾病。因此临床试验主要设计为检验基因治疗在ra患者的可行性、安全性和便利性。治疗过程包括：①病人首先接受第一掌指关节手术，分离、获取自体滑膜细胞。②体外培养滑膜细胞。一半细胞通过逆转录病毒载体转导人il-1ra cdna，另一半未转导的细胞为对照。③经过极其严格的安全和质量筛选，相同数量转导和未转导的细胞，分别随机双盲地注射到患者同手的2～5四个受累掌指关节。④1周后，手术置换这4个关节。分离关节滑膜，进行基因治疗的分析。目前，世界上至少有2个应用类似方案的ra基因治疗一期临床试验正在进行中。未发表的初步结果显示，将治疗基因在ra关节导入、表达，是安全的和可能的［2，3］。
　　5　展望和问题
　　在短短的几年内，ra基因治疗已从动物实验进入了临床试验。2003年，人类基因组计划预计完成，这很可能为ra今后的基因治疗开创新的前景。最近，在分离和体外培养人体干细胞上取得的重要进展，也可能为ra基因治疗提供新的途径。基因治疗也为ra发病机制的研究提供了新的手段。
　　目前基因治疗存在的最大技术难题就是缺乏理想的导入系统，不能使治疗基因按需要表达。迄今为止，世界范围内300多个临床研究中，3 000多个病人已接受了基因治疗，值得注意的是，没有1例明确显示了临床改善［4］。最近第1例基因治疗导致患者死亡的报道，强烈提示基因治疗的安全性问题不容忽视［32］。此外，基因治疗的费用、便利、伦理道德等问题亦需解决。和其他正在发展中的ra生物治疗相比较，基因治疗在理论和实践上的优势并不显著［1-3］。基因治疗在ra动物模型中已取得了令人鼓舞的结果，但是处于幼儿期的基因治疗能否真正成为ra治疗的有效武器之一，还有待时间的证明。
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人基因治疗研究和制剂质量控制技术指导原则
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　　一、引言　　基因治疗是指改变细胞遗传物质为基础的医学治疗。目前仅限于体细胞。　　基因治疗的技术和方式日趋多样性。按基因导入的形式，分为体外基因导入（exvivo）及体内基因导入（invivo）两种形式。前者是在体外将基因导入人细胞，然后将该细胞注入人体。其制品形式是外源基因转化的细胞，适合在具有专门技术人才和GMP条件的医疗单位进行。后者则是将基因通过适当的导入系统直接导入人体，包括病毒的与非病毒的方法。其制品形式是基因工程技术改造的病毒或者是重组DNA、或者是DNA复（混）合物。基因治疗制剂种类较多，因此，本指导原则不可能用一个模式来概括，只能提出一个共同的原则，具体的方案应根据这些原则，确定研究技术路线。其基本原则：一是必须确保安全与有效，要充分估计可能遇到的风险，并提出相应的质控要求；二是要促进基因治疗的研究，并加强创新。对一些新的治疗技术路线的相应质控要求，可有一定的灵活性，应注意到基因治疗本身的特点以及它与经典的化学合成药物或基因工程药物的差别。目前，一些基因治疗研究相对比较成熟，而一些则不够完善，更加要求研究者在使用该技术指导原则时不可生搬硬套。为此，研究者应加强咨询和论证，提出一个科学可行的研究方案，最终获得确保安全有效的基因治疗制品。　　在向国家药品监督管理局申报临床试验时，除须按本指导原则中“研究内容和制品质量控制”准备材料外，同时需提供下述材料：　　（1）国内外研究现状和进展（综述）。包括：　　1．所用基因的研究现状和进展；　　2．所用载体的研究现状和进展；　　3．所用基因导入系统和方法的研究现状和进展；　　4．该研究或制品相关的体外有效性实验资料；　　5．该研究或制品相关的动物试验安全性和有效性资料；　　6．该研究或制品相关的临床试验安全性和有效性资料；　　7．该研究或制品的生产工艺现状；　　8．该研究或制品的质量控制现状；　　9．本研究或制品的先进性和创新点；　　10．本研究或制品产业化的可行性。综述内容须科学客观。　　（二）本研究或制品的知识产权情况。包括：1）本研究或制品的知识产权情况阐述；2）本研究或制品的知识产权检索报告和检索结果。知识产权情况的阐述和检索应包括所用基因、载体、重组体、终产品的其它成分、生产用细胞和生产工艺等。　　二、研究内容和制品质量控制　　（一）DNA重组体或基因导入系统的构建　　1．治疗用的目的基因　　详细说明基因治疗所用的目的基因及其来源（尤其是有否涉及国内外专利问题，应有专利查询资料），获得目的基因的材料方法和基因鉴定结果。　　2．载体　　包括载体DNA的限制性内切酶图谱或基因库资料。若有特殊的元件，如启动子、增强子及PolyA位点等，应提供详细资料。若有改变结构（如丢失片段，点突变或插入片段），须提供DNA测序结果。若属新的或改变结构的病毒载体，须提供组建的材料、方法、组建步骤及鉴定结果的全部资料。　　非病毒型基因导入系统，均需一个能在人体细胞表达目的基因的质粒。除裸露DNA外，还须附加其它的组分进行加工，如脂质体、多肽、金属颗粒等。本指导原则不包括寡聚核苷酸（如AntisenseRNA,Ribozyme,RNAi等）类基因治疗制品。　　3．DNA重组体　　详细说明克隆步骤，材料方法；DNA序列分析图谱和结果，注明启动子、增强子、插入顺序、目的基因及polyA顺序等；重组体的限制性酶切图谱和鉴定结果；重组体中基因表达水平和时程。　　4．基因导入系统构建包括病毒载体与非病毒载体基因导入系统。　　（1）病毒载体基因导入系统包括腺病毒载体、逆转录病毒载体和腺相关病毒载体基因导入系统等。需详细描述形成单克隆原始病毒颗粒的方法、材料、技术路线和全部的鉴定方法、标准和结果。这些鉴定一般包括：结构鉴定（限制性酶切图谱和PCR分析）、整个病毒的序列分析（≤40kb），基因体外表达和生物活性，SDS-PAGE、表达盒DNA序列分析、Westernblot分析、转染效率、透射电镜负染法观察、复制型病毒的检测和其它污染因子的检测。　　（2）非病毒基因导入系统除裸DNA外，一般包括两个部分：一是哺乳动物细胞表达载体；二是其它载体物质，如脂质体、多肽或金属粒子等。为此，需说明目的基因导入系统的性质与内容。由于部分病人对青霉素的过敏反应，最好不用耐氨苄青霉素基因作耐药基因，而建议用卡那霉素或新霉素基因作耐药基因。若用物理方法导入，须提供其详细方法、步骤，基因导入效率及其表达的生物活性以及导入细胞后基因的稳定性，无重排或突变的证据。每一操作步骤必须鉴定其结果，通常的鉴定内容和方法有：限制性酶切图谱，基因的PCR扩增，表达盒DNA序列分析，SDS-PAGE，Westernblot分析等。　　（二）细胞库及工程菌库的建立和检定　　包括包装和繁殖重组病毒的细胞库和扩增重组质粒的工程菌库。必须建立三级库，即原始细胞库（PrimarySeedBank）、种子细胞库（MasterCellBank）和工作细胞库（WorkingCellbank）；或原始工程菌库、种子工程菌库和工作工程菌库。　　1．细胞库　　（1）原始细胞库　　需说明来源、代数、细胞特性及有关档案资料。对主细胞库和工作细胞库需详细说明建库过程，包括材料、方法、步骤、细胞库存的数量和登记档案等。　　（2）主细胞库　　主细胞库由原始细胞库直接传代建立或通过亚克隆方法筛选后建立。应明确使用代次。　　（3）工作细胞库　　工作细胞库由主细胞库传代建立。应明确工作细胞库的使用代次。　　（4）细胞库检定　　①主细胞库或工作细胞库检定应依据《生物制品生产用细胞的制备及检定规程》的要求进行。　　②病毒转导效率和病毒的产量等的检定　　③导入基因的存在状态，稳定性及其表达水平的检测　　④复制型病毒的检测　　若需用其它辅助病毒，须说明其来源、分离的方法步骤和传代次数等。　　2．工程菌库　　工程菌主种子库和工作种子库的建立和检测应按现行《中国药典》相关要求建立。　　（1）工程菌主种子库的检定　　①菌种同一性鉴定：菌种/株的来源、基因型及表型。基因型通　　过RAPD方法鉴定，通过测定重组质粒的特殊标记和抗药性标记确定表型。　　②菌种培养纯度检定：外源因子（如杂菌、真菌、噬菌体等）的检测。　　③菌种稳定性检定：转化菌的比例，扩增条件、质粒拷贝数，基因表达量、允许的传代次数。　　④基因表达盒序列分析：插入的目的片段以及调控序列进行测序分析。　　（2）工程菌工作种子库的检定　　除外基因表达盒序列分析，其它检定内容按上述工程菌主种子细胞库的检定。　　（三）基因治疗制品制备和生产工艺　　1．一般要求　　（1）制备和生产条件及环境说明。强调基因治疗制品的制备和生产须按GMP要求进行，特别是对exvivo方式的细胞制品和重组病毒制品。临床前研究和临床研究用的重组病毒制品应该在经验证的（validatable）生产工艺途径下制备。　　（2）详细的制备和生产工艺方法、材料和技术路线。　　（3）制备和生产过程控制。在生产过程中，一些步骤必须进行监测，并要求有监测记录。　　（4）一批制品生产的原始制造及检定记录。　　（5）中国药品生物制品检定所或由国家药品监督管理局指定的单位对一批制品的检定报告。　　2．以重组病毒作为基因治疗制品者，要求必须建立种子病毒库和工作病毒库。工作病毒库直接从种子病毒库病毒接种细胞传代制备。需详细描述病毒库的来源、建立、克隆性，传代和保存条件和方法。其质量控制方法和标准见本指导原则有关部分。须从工作细胞库细胞复苏，传代成生产细胞开始工艺过程，不得用非细胞库来源的细胞直接进行生产。做重组病毒制品时，须使用工作病毒库的病毒去感染生产细胞，不得用非病毒库来源的病毒直接进行生产。可以使用贴壁细胞或悬浮细胞大规模培养技术。病毒库可以不经过纯化而直接从细胞裂解液来制备。制剂配方也十分重要，不合适的制剂配方会影响制品活性和保存期限。　　3．非病毒型重组质粒DNA复（混）合物作为最终制品者，要求需详述。　　（1）重组质粒DNA的生产制备和质控　　（2）脂质体的来源和性质，或者制备方法　　（3）多肽的来源和性质，或者合成方法　　（4）其它成分的来源和性质，或者制备方法　　（5）重组质粒DNA复（混）合物终制品的生产制备和质控　　通过基因***等物理和化学方法将基因导入人体者，需说明目的基因的制备、表达、裸DNA大量扩增、分离、纯化，仪器设备的性能和详细的导入方法。　　4．以基因工程化的细胞为最终制品者，包括exvivo及其它形式的基因治疗。该类制品应参照《人体细胞治疗研究和制剂质量控制技术指导原则》进行。详细说明细胞扩增的全部制备工艺，包括生产流程、所用培养液及其配制方法、细胞收集、细胞的exvivo转染方法及筛选。洗涤最终制品中所用的保存液配方。　　（四）制品的质量控制　　根据基因治疗类制品的生产工艺特点，其质量控制的原则主要是：检定项目尽可能在成品中进行；如成品中的添加成份影响检定结果，则需在原液中进行。　　1．重组病毒作为基因治疗制品的质量控制　　根据目前国内外的进展和完善程度，这里以重组腺病毒（rAd）制品制品来描述重组病毒基因治疗制品的质量控制，其它的重组病毒制品可参考这些质控要点。　　（1）重组腺病毒（rAd）作为基因治疗制品的质量控制　　①原液检定：　　a．无菌试验　　按2000年版《中国生物制品规程》附录《生物制品无菌试验规程》进行。　　b．病毒颗粒数测定　　c．具有感染能力病毒颗粒的测定（病毒活性）　　②半成品检定　　a．无菌试验　　b．病毒颗粒数测定　　c．内毒素测定　　③成品检定　　a．物理检查　　b．外观　　c．装量　　d．化学检定：pH值　　e．鉴别试验　　限制性酶切图谱鉴别　　插入基因检测　　f．纯度：可采用A260nm/A280nm值法或HPLC法　　g．病毒滴度测定　　病毒颗粒数测定,采用A260紫外吸收法测定。?　　具有感染能力病毒颗粒的测定,采用TCID50法。〖ZK）〗　　病毒比滴度（比活性IU）,病毒感染滴度/病毒颗粒数（IU／VP）应高于3．3％。　　h．效力试验　　插入基因表达活性测定　　插入基因的生物学活性测定　　i．复制型病毒（RCA）检测　　A549细胞检测法，每3．0×1010VP中应不高于1RCA（即≤1RCA/3．0×1010VP）　　j．腺相关病毒的检测　　采用PCR法，应无腺相关病毒（A***）的污染。　　k．残留量测定　　应根据生产工艺及成品的添加成份，对有潜在危险性的成份进行残留量检测。　　l．无菌试验　　m．异常毒性试验　　n．内毒素检测　　重组病毒制品的稳定性试验：需对保存条件、保存液配方及至少对三批样品进行稳定性考察。应进行不同温度及反复冻融对活性影响的研究。　　（2）以exvivo形式用逆转录病毒转化的细胞（同体或异体）制品的质量控制　　该类制品应参照《人体细胞治疗研究和制剂质量控制技术指导原则》进行。应特别注意复制型病毒的检测。检测的范围，包括前述种子细胞库、工作细胞库，生产后细胞及最后病毒制品。细胞上清液的取样应相当于培养上清液的5％。生产病毒后细胞取样量须达每批中1％或108细胞（取少的）。检测方法应包括至少5代的细胞共培养扩增（如用Musdunni细胞），随后须用PG4S+/L-法、标记挽救法或RT／PCR中的两种方法来检测。必须用阳性对照（COS4070A上清液）及阴性对照作严格定量标化，证明其敏感性及可靠性。PCR应利用放射性同位素杂交或同样敏感的系统。　　若为释放病毒的细胞，须测定：　　①细胞形态、表面标志、染色体组型及其同一性。　　②活细胞比例和细胞浓度。　　③目的基因存在状态、表达及其稳定性。尤其要说明对基因及其载体导入后是否出现基因“插入性突变”及其观察方法及结果。　　④细胞冻融后的质控　　冻融后细胞存活数、基因表达或转导基因的活性。　　冻融后细胞上清液中的下列检测结果：　　a．无菌试验　　b．热原质实验　　c．冻融后细胞的异常毒性试验。　　d．病毒转导基因活性。　　e．支原体检查。　　若为逆转录病毒上清液，须测定：　　①病毒滴度　　②病毒结构检定　　③病毒转导基因的活性　　④复制型病毒（RCR）的检测。由于逆转录病毒或RCR具有　　整合入人细胞染色体的特性，有遗传性毒性，因此对制品中RCR的检测要严格进行和严格要求。　　⑤上清液中的细菌、热原质及其它外源因子等。　　⑥上清液中牛血清蛋白残留量。　　鉴于某些细胞产品，有效期较短，而有些项目的检查须较长的时间（如支原体），这些试验项目可对每批最终产品作留样检查，而该检测结果将为产品的质控提供完整的资料。若留样检查发现阳性结果，应及时对生产过程作检查，对已发放的产品立即采取措施停止使用。　　2．非病毒型重组DNA基因治疗制品　　（1）纯度：超螺旋型的含量，细菌基因组DNA、RNA和蛋白残留量。　　（2）DNA结构检测　　（3）脂质体、多肽或金属粒子等的来源和性质。由于脂质体的形成及多肽类合成过程的随机性，不可能达到一般化学合成物的均一性及纯度，为此应提供不同批号间保证安全有效的可以达到的最大均一性的程度。　　（4）无菌试验　　（5）热原质试验　　（6）过敏试验　　（7）异常毒性试验　　（8）介导目的基因的活性检测　　（9）有害物质残余量的测定　　（五）基因治疗的有效性试验　　有效性试验包括：　　1．体外试验　　须证明该外源基因导入细胞后，能表达并能达到治疗效果的依据。若属exvivo，须提供该细胞中目的基因的表达量及细胞导人体内后预期的效果。　　2．体内试验　　提供动物实验结果证明在体内靶组织中基因导入的效率、表达状态及可达到治疗的目的。证明在非靶组织***中基因表达的分布。动物种类根据实验模型的需要而定。导入的途径应尽可能接近于临床试验的途径或条件。由于小动物对某些途径（如动脉插管）有一定困难，若改变导入途径须说明原因及依据。　　若有些方案在动物中难以观察其疗效（如种族差异），应充分提供有效性的间接或旁证资料或依据。　　（六）基因治疗的安全试验　　对质控合格的基因治疗制剂，须提供以下安全性试验的资料：　　1．总体安全性评估　　除了在质控中已规定的各项要求外，对于exvivo用基因工程化的自体或异体细胞导人体，应提供以下资料：　　（1）生长因子的依赖性细胞，对其生长行为必须予以监检。若某细胞株在传代过程中失去对该生长因子的依赖性，不能再予以使用。　　（2）对同种异体细胞的移植，必须从免疫学方面提供其安全性依据。　　（3）对异种细胞，必须提供该异种细胞在体内存活的时间及其安全性的依据。　　（4）致癌试验。无论是自体或异体细胞，经基因操作后，均须作致瘤试验。对于瘤苗类制品，必须提供该瘤细胞经过何种处理能有效地阻止继续增殖的证据。致癌试验包括软琼脂细胞生长及裸鼠内致癌试验。　　（5）细胞种类均一性的监控。对瘤苗类制品，应提供如何去除非肿瘤细胞的方法、步骤及其可靠性的依据。若从肿瘤组织中分离非肿瘤细胞（如淋巴细胞），则必须提供消除肿瘤细胞的方法、步骤及其可靠性（包括致癌试验在内）的依据。　　（6）复制型病毒的检测，若应用病毒型导入系统必须严格检查复制型病毒。　　（7）添加物：除细胞培养及保存所用的试剂外，某些exvivo或invivo导入基因或细胞时，需要加用其它添加物，对此类物质必须有动物实验证明其安全性。　　2．分子遗传学的评估　　对invivo的治疗方案，必须提供动物体内重组病毒或重组DNA制品导入靶组织与非靶组织的分布情况、基因的表达情况。对于exvivo的方案。须提供导入基因的细胞进入体内后的活性和目的基因的表达情况和分布。　　3．毒性反应的评估　　这是安全性试验的重要组成部分。invivo的方案必须提供毒性反应的详细资料。除目的基因可能导致的毒性外，导入系统的安全性评价至为重要，其安全性评估应包括急性毒性（最大耐受量）及长期毒性试验。毒性试验所用的剂量，除包括相当于临床使用剂量（按体重或表面积计算）外，尚需有一个较大的剂量范围。剂量范围应包括大于临床使用剂量以确定最大耐受量。给药途径应尽可能模拟临床给药或导入的形式。若改变途径须说明其原因及依据。毒性反应的观察，除常规检测项目外。应包括与基因治疗相关的检测指标。　　对于exvivo方案，对瘤苗类或淋巴细胞、巨噬细胞类等自体细胞的导入，一般可免做动物急性和长期毒性试验。但若加入特殊的添加物（如明胶、缝线、特殊的导管等），以及对于某些重要人体脏器内导入（如心、脑、肝等），必须作动物体内毒性作用的试验，并提供详细资料。若exvivo方案添加细胞因子，亦必须提供其安全性的资料。对采用皮肤、皮下、肌肉给药途径的方案，无论是exvivo或invivo均需提供局部刺激性的资料。　　4．免疫学的评估　　无论病毒型与非病毒型载体系统，均需注意进入体内后的免疫反应有关的问题，包括过敏反应、排斥反应以及机体的自身免疫反应（如对裸DNA）等，并对可能发生的免疫反应提出相应的监控及处理措施。　　对用于改变机体免疫状态的目的基因及其导入系统（如瘤苗、导入细胞因子基因或输入基因工程化的免疫细胞），更需提供它所引起的机体免疫改变以及可能的副作用的资料（参照《人体细胞治疗研究和制剂质量控制技术指导原则》）。　　5．致癌试验：见本指导原则相关部分。　　（七）基因治疗临床试验方案　　基因治疗不同于一般生物技术制品的临床应用，首先是它的复杂性，例如对于exvivo方式，需有经验的临床单位和专家将制品输入或埋入人体的特定组织，甚至通过手术进行操作；二是它的风险性，尚存在许多未知的因素，须对临床研究的全过程进行严密监控，并在申请临床研究时须提供下列资料：　　1．提供申报单位符合GMP生产条件的证明。　　2．提供临床研究单位和直接参与研究人员的名单和简历。　　3．明确给药的方式、剂量、时间及疗程。如需通过特殊的手术导入治疗制剂，须提供详细的操作过程。　　4．一般临床指标和实验室检测。　　5．病人及家属的同意书　　6．靶组织和非靶组织的分子生物学检测。　　靶组织和非靶组织的分子免疫学检测。若导入重组病毒或可能改变机体免疫状态的制剂，须针对性地提供观察人体免疫学方面的相关检测指标及对可能发生的免疫学反应的必要处理措施。　　7．可能产生的副作用或不良反应的记录，建立实施治疗方案中的事故报告制度。　　8．随访的计划及实施办法。　　（八）伦理学考虑　　必须充分重视伦理学的原则，并具体按国家药品监督管理局GCP规定的要求严格实施。包括在实施本方案前，须向病人说明该治疗方案属试验阶段，它可能的有效性及可能发生的风险，同时保证病人有权选择该方案治疗或中止该方案治疗，以及保证一旦中止治疗能得到其它治疗的权利。严格保护病人的隐私。在病人及家属充分理解并签字后才能开始治疗。
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