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《镇魔曲》1300万游戏概念电影曝光 1080P壁纸
作者： 大师兄 来源： 178新游戏频道
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fast digest 酶切p1300-35S载体，切半个小时切不干净是怎么回事，本人新手，求指点~~~
p1300-35S载体上面的kpnI以及speI两个酶切位点，用fast digest 快切酶酶切，体系
载体& && && && && && &40μl
kpnI& && && && && && &1μl
speI& && && && && && & 1μl
green buffer& && & 5μl
ddH2O& && && && && &3μl
total& && && && && && &50μl
酶切30分钟，切完之后，做胶回收以及检测，看条带大小都符合预期（约10k），但是与基因做连接的时候，做了一个空载的对照，用DH5α 大肠杆菌感受态转化以后，对照空载也长了单菌落（3个），说明载体没切干净，请问这种情况下该怎么办
质粒浓度一般不超过1微克，我这个总共也只有800ng，应该不多吧
fast digest 这个你用的多不，说明书上说的是5-15分钟即可，我切的是30分钟，之前有酶切过夜，不过酶切后貌似载体有杂带出现，也就是可能伴随有切到其他位点的情况，这个问题你碰到过么
实际上你并不需要那么多吧，做连接的话只要一点点就够，不能贪多，否则阳性率低，我这边基本上可以做到接近100%的阳性率
做连接 的话，你一般大概用多少纳克载体，多少纳克片段呀，我这个载体大概10K，片段0.7k和0.9k
我不测浓度的，你可以切个梯度，尽量少切
一点点是多少纳克呀
切梯度，这个也可以做梯度呀，果然眼前亮了，梯度一般切几个
我们实验室一直用FastDigest，说明书上给的时间（5-15分钟）一般是理想条件下的，但实际上经常需要更长的时间（可能的原因包括酶储存时间过长或保存不当，导致酶活度下降；质粒的某些supercoil form的构象屏蔽了内切酶的识别序列，导致酶切效率降低，等等）。
酶切后出现杂带很有可能是由于star activity（主要原因有酶切时间过长，甘油浓度高于5%），可以查一下该酶的使用说明书，用说明书上推荐的条件来设置酶切反应。
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