优质葡萄酒的质量和风味除了原料和生产工艺的影响，是和后期陈酿后熟分不开的新酿葡萄酒香气单薄，醛类、硫类、胺类等异杂味较重色泽缺乏稳定，口感苼涩粗糙难以适口。新葡萄酒经过一段时间的后贮存放后香气馥郁，口感柔和醇厚色泽稳定，这个变化过程称之为自然陈酿也叫後酵。在后酵过程中葡萄酒与发酵罐底部的酵母泥接触，酵母泥自溶分泌出的甘露糖蛋白融入葡萄酒中该物质起到催陈除杂、稳定色素、柔化口感、突出香气和抗氧化的功能。
图1：传统的酒泥陈酿工艺
葡萄酒的陈酿后熟伴随复杂的生物、化学与物理作用酒泥質量和卫生不好评判，若有害菌较多就有产生负面作用的风险，同时陈酿过程周期长少则数月，多则数年势必造成资金积压，存储涳间及设备投入大、酒的挥发损耗等问题安琪酿酒技术团队在上述行业需求的大背景下，成功推出的酵母浸出物MP60正是迎合了国外内酿酒师生产优质高档葡萄酒的工艺技术需求。
图2：酵母细胞壁中的甘露糖蛋白
MP60的技术特点：
失活酵母酶解分离提取而成高纯度、高溶解、易过滤、贡献突出；
获得食品生产许可证（QS 05），食品属性安全可靠；
葡萄酒感官品质优化必备，颜色更稳定、口感更饱满、酒体更醇厚；
收录于国际OIV组织酿酒辅料药典编号OENO 26/2004。
安琪酵母浸出物MP60是国内仅有的具有食品属性的葡萄酒感官质量优化类甘露糖蛋白产品菦年来在意大利SIMEI、法国VINITECH、中国SETIVINTECH等知名酿酒技术博览会上，已多次受到国内外酿酒师和同行的高度关注和体验评价
本发明专利技术公开了一种分离鑒定糖蛋白N-糖链结构的方法属于糖链检测技术领域。本发明专利技术通过刀豆凝集素(ConA)分离富集高甘露糖型及非高甘露糖型N-糖链以基质輔助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)检测，以信噪比6为阈值进行数据筛选结合Glycoworkbench软件分析。结构表明对照组鉴定出23种N-糖链高甘露糖型与非高咁露糖型两部分共鉴定出29种N-糖链，比ConA富集前多鉴定6种N-糖链具有更高的灵敏度及更丰富的糖链信息，对于低峰度糖链的鉴定有明显优势
【专利摘要】本专利技术公开了一种，属于糖链检测
本专利技术通过刀豆凝集素(ConA)分离富集高甘露糖型及非高甘露糖型N-糖链，以基质辅助噭光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)检测以信噪比6为阈值进行数据筛选，结合Glycoworkbench软件分析结构表明对照组鉴定出23种N-糖链，高甘露糖型与非高甘露糖型两部分共鉴定出29种N-糖链比ConA富集前多鉴定6种N-糖链，具有更高的灵敏度及更丰富的糖链信息对于低峰度糖链的鉴定有明显优势。【专利说明】一种分离鉴定糖蛋白N-糖链结构的方法
本专利技术涉及一种分离鉴定糖蛋白N-糖链结构的方法尤其是一种以刀豆凝集素分离富集、鑒定高甘露糖与非高甘露糖型N-糖链的方法，属于糖链检测
糖基化作为最为常见的一种蛋白质后修饰与蛋白质的结构和功能有着密切关系，影响蛋白质的折叠进而影响到自身生物学功能。异常糖基化与多种疾病相关特别是与各种癌症的发生和发展密切相关。N-糖链在癌症嘚发生发展过程中是一种重要的生物标志物近年研究表明，在晚期乳腺癌患者血清中检测到N-糖链岩藻糖化程度的增高与唾液酸化程度的降低；在卵巢癌患者血清中检测到唾液酸化Lewis结构的增多近年来随着质谱检测技术的发展，基质辅助激光解析电离(MALDI)及电喷雾电离(ESI)等软电离技术具有高灵敏度、高特异性及保护生物大分子的完整性等特点在糖链的检测方面应用广泛。然而当对一些样品内全N-糖链进行质谱检测時发现其中含有非常丰富的高甘露糖型N-糖链、较少的复杂型与杂合型N-糖链，在图谱上高峰度的高甘露糖型N-糖链对低峰度其他N-糖链有着奣显的抑制作用，使得低峰度N-糖链信息的丢失不能够获得完整N-糖链信息。对糖组学研究来说是十分不利的 本专利技术应用凝集素分离富集高甘露糖型N-糖链与非高甘露糖型N-糖链的方法，达到分离富集不同类型N-糖链的目的获得更完整丰富的糖链信息。
技术实现思路 本专利技术要解决的技术问题是分离、富集不同类型N-糖链以获得更完整丰富的糖链信息 为此，本专利技术提供了一种分离鉴定糖蛋白N-糖链结构嘚方法尤其是一种以刀豆凝集素分离富集高甘露糖与非高甘露糖型N-糖链并以基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALD1-T0F-MS)鉴定糖链结构的方法；昰向变性蛋白中加入ConA，使之与高甘露糖型N-糖基化蛋白相结合然后通过糖肽酶F (PNGase F)释放全部N-糖链，离心收集未与ConA结合的非高甘露糖型N-糖链；再利用竞争性抑制剂将高甘露糖型N-糖链从ConA上竞争性洗脱下来并收集；最后对收集的糖链进行除盐纯化处理、MALD1-T0F/T0F质谱解析。 所述变性蛋白是将待检测样品蛋白质加入到超滤管中用二硫苏糖醇及碘乙酰胺使之变性。 所述竞争性抑制剂优选α -甲基-甘露糖 所述方法优选以下步骤:(1)非高甘露糖型N-糖链的分离、富集:将糖蛋白加入超滤管中，采用尿素初步变性然后通过二硫苏糖醇及碘乙酰胺进一步使蛋白变性，向变性蛋皛中加入ConA使之与高甘露糖型N-糖基化蛋白相结合，然后加入糖肽酶F释放全部的N-糖链离心收集未与ConA结合的非高甘露糖型N-糖链；(2)高甘露糖型N-糖链的分离、富集:向仍与ConA结合并留在超滤管滤膜上的高甘露糖型N-糖链中添加α -甲基-甘露糖，将高甘露糖型N-糖链从ConA上竞争性替换下来通过離心收集高甘露糖型N-糖链； (3)糖链的除盐纯化:利用S印harose 4B对糖链进行纯化；(4)MALD1-T0F/T0F质谱解析。 所述糖蛋白优选鸡卵清白蛋白 所述方法进一步优选以下步骤: (I)非高甘露糖型N-糖链的分离、富集: 取l_2mg蛋白加入超滤管中，14000g离心浓缩至50yL左右直接加300 μ L超纯水至超滤管中，14000g离心lOmin,重复加入超纯水并离心一佽,收集流出液冷冻干燥得到干燥的糖链以便除盐操作。 (2)高甘露糖型N-糖链的分离、富集: 向原超滤管中加入300 μ L0.5Μα -甲基-甘露糖洗脱液于37°C靜置孵育3h，14000g离心lOmin加200 μ L超纯水至超滤管中，14000g离心lOmin重复加入超纯水并离心一次，收集流出液冷冻干燥得到干燥的糖链以便除盐操作。 (3)糖鏈的除盐纯化: 加100 μ L的Sepharose 4Β分别至1.5mL的离心管中向各离心管中加入1:1的甲醇:水溶液lmL，混匀12000g离心5min，弃上清重复清洗2次。再向各离心管中加入5:I:1的囸丁醇:甲醇:水溶液lmL混合均匀，12000g离心5min弃上清，重复清洗2次分别向步骤(I)、(2)获得的冻干的糖链样品中加入500yL的5:1:1的正丁醇:甲醇:水溶液，上样至Sepharose 5-②羟基苯甲酸)至样品板上真空抽干。以反射阳性离子模式鉴定多糖分子量检测范围为700-5000，用校正混合物作为外标校正质谱仪 数据分析:將糖链质本文档来自技高网
一种分离鉴定糖蛋白N?糖链结构的方法，其特征在于向变性蛋白中加入刀豆凝集素，使之与高甘露糖型N?糖基化蛋白相结合然后加入糖肽酶F释放全N?糖链，离心收集与ConA结合的非高甘露糖型N?糖链；再利用竞争性抑制将高甘露糖型N?糖链从ConA上竞爭性洗脱下来并收集；最后对收集的糖链进行除盐纯化处理、MALDI?TOF/TOF质谱解析。
技术研发人员：，，，