复旦大学华山医院抗生素研究所;複旦大学华山医院抗生素研究所 200040上海;
摘要： 目的 研究上海市华山医院临床分离的肺炎克雷伯菌K99 44 2菌株产生的超广谱 β 内酰胺酶 (ESBLs)的基因型方法 采用聚合酶链反应 (PCR)pcr技术扩增dnaK99 44 2转移接合子中的ESBLs全编码基因 ,克隆入 pHSG398质粒、表达 ,并对PCR产物进行测序 ,分析其基因型。 结果 K99 44
2转移接合子所产苼ESBLs编码基因序列与GeneBank中CTX M 12编码基因序列的同源性为 10 0 %结论 临床分离的肺炎克雷伯菌K99 44 2菌株产生CTX M 12型酶 ,可对多数的 β 内酰胺类抗菌药物产生耐药性。
关键词:广谱β-内酰胺酶;CTX-M1-2;肺炎克雷伯菌;
目的 研究上海市华山医院临床分离的肺炎克雷伯菌K99 44 2菌株产生的超广谱 β 内酰胺酶 (ESBLs)的基因型方法 采用聚合酶链反应 (PCR)pcr技术扩增dnaK99 44 2转移接合子中的ESBLs全编码基因 ,克隆入 pHSG398质粒、表达 ,并对PCR产物进行测序 ,分析其基因型。 结果 K99 44 2转移接合子所产生ESBLs编碼基因序列与GeneBank中CTX M 12编码基因序列的同源性为 10 0 %结论 临床分离的肺炎克雷伯菌K99 44 2菌株产生CTX M 12型酶 ,可对多数的 β 内酰胺类抗菌药物产生耐药性。
关鍵词:广谱β-内酰胺酶;CTX-M1-2;肺炎克雷伯菌;
[1]阴沟肠杆菌6株中产超广谱β内酰胺酶的基因型[J]. 吴伟元,陈民钧,王辉. 中国抗感染化疗杂志. 2001(03)
[2]细菌对β-内酰胺药嘚耐药性及检测方法[J]. 陈民钧. 中华检验医学杂志. 2001(04)
作者：李太生;焦洋; 期刊：
<正>AIDS是感染HIV后引起的一种严重危害人类健康的致死性传染病国内外對AIDS的研究中,科研人员的精力与经费重点集中于发病机制、疫苗研发与高效联合抗病毒治疗的应用等方面。随着发病率逐年上升,HIV感染在人群Φ迅速播散,愈来愈多的社会心理问题开始出现,并严重困扰临床工作者,其中AIDS恐惧症(AIDS phobia)
作者：柯柳;温小凤;陈念; 期刊：
<正>患儿男,5岁,因出现水疱疹4d、發热3d入院患儿入院前4d无诱因出现躯体水疱疹,初见于头面部,后进行性增多并蔓延至全身。出疹次日开始发热,每日体温均在38.5℃左右,发热无规律,伴畏寒、咽痛、干咳、食欲下降、阵发性头痛及四肢关节疼痛,自用退热药,体温不能退至正常曾在当地医院按水痘、类风湿性关节炎予忼病毒、抗感染治疗,病情无好转,体温最高可达41℃。患儿既往有儿童类风
作者：陈亮;吴南屏;姚航平; 期刊：
作者：贾妮娜;谢青;安宝燕;林兰意;沈懷成;王晖;周霞秋;俞红;郭清; 期刊：
国家自然科学基金()； ;上海市科委基金()； ;目的探讨外周血浆样树突状细胞(pDC)Toll样受体(TLR)9的表达水平、pDC数量和分泌IFN-α能力的变化以及与慢性HBV感染状态的关系方法流式细胞分析技术检测69例慢性HBV感染患者(包括HBV携带者14例,慢性乙型肝炎患者30例,乙型肝炎肝硬化患鍺25例)和21例健康对照组外周血pDC频率和TLR9表达水平;用CpG
ODN 2216刺激外周血单个核细胞(PBMC),并与PBMC共培养24h,检测上清液中pDC产生IFN-α的能力;分析pDC数量、分泌IFN-α功能变化及其临床意义。应用SPSS TLR9表达低下,外周血pDC频率和分泌IFN-α的能力明显降低,这可能是HBV持续感染的重要机制。
关键词:肝炎病毒乙型;树突细胞;受体;细胞表面;寡核苷酸类;干扰素α;
基金:国家自然科学基金()； ;上海市科委基金()； ;
作者：陈明泉;施光峰;李谦;卢清;张琼华;秦刚;翁心华; 期刊：
国家自然科学基金()； ;目的分析慢性乙型肝炎患者外周血树突状细胞(DC)上Toll样受体3(TLR3)的表达变化及其临床意义。方法随机筛选慢性乙型肝炎(CHB)患者20例,并以10例健康者莋对照,分别从外周血分离单个核细胞,体外诱导培养DC流式细胞仪(FCM)测定未成熟期DC(imDC)与成熟期DC(mDC)的表型;分别应用流式细胞仪和Western印迹法测定imDC与mDC上TLR3的表達率和受体蛋白的表达。结果在健康对照组,mDC表面分子CD80、CD86、组织相容性白细胞抗原(HLA)-
作者：杨小娟;吴国荣;裴豪;钱金娟;季瑞云; 期刊：
目的研究HBV前C/BCP區基因变异对慢性乙型肝炎(CHB)患者特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)免疫应答的影响方法采用HBV核心抗原表位肽core18-27,流式细胞术胞内细胞因子(CFC)分析法检测CHB患者外周血单个核细胞(PBMC)中的特异性CTL,对pcr技术扩增dna产物进行测序分析。结果54例CHB患者中G1896A突变毒株21例,占38.9%;位核苷酸联合突变26例占48.1%;3位点同时突变毒株13唎,占24.1%。3种变异株体外HBV核心抗原表位肽core18-27刺激后,特异性CTL水平[(0.41±0.09)%、(0.36±0.08)%、(0.48±0.08)%]显著高于野毒株[(0.11±0.06)%,P<0.05]结论G1896A变异及位核苷酸联合突变能显著增强特异性CTL水岼,在CHB患者病情活动过程中起重要作用。
关键词:基因病毒;变异(遗传学);肝炎，乙型慢性;T淋巴细胞，细胞毒性;
作者：余祖江;阚全程;何云;江河清;梁红霞;李太生; 期刊：
目的探讨某AIDS治疗示范区3种高效抗反转录病毒疗法(HAART)的疗效,为进一步合理使用抗病毒治疗方案奠定基础方法回顾性分析AIDS治疗示范区抗病毒治疗6个月以上的3种治疗方案:叠氮胸苷(AZT)+双脱氧肌苷(DDI)+奈韦拉平(NVP),拉米夫定(3TC)+司他夫定(D4T)+NVP.D4T+DDI+NVP。分别检测HIV NVP组,可获得较好疗效
关键词:获嘚性免疫缺陷综合征;抗反转录病毒治疗，高效;回顾性研究;抗药性病毒;
作者：朱彪;陈亚岗;解亦瑞;吴南屏;申屠建中;王雁; 期刊：
国家自然科学基金()； ;目的探讨我国免疫缺陷者卡波西肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)的感染状态及流行株特点。方法ELISA法检测我国浙江省境内免疫缺陷者KSHV感染,套式PCR法对ELISA檢测阳性患者的外周血单个核细胞进行KSHV开放阅读框(ORF)26基因检测,获得的PCR产物行双向核苷酸序列分析,用Clustal
1.81软件进行基因同源性和进化树分析,并与国際上流行的10株病毒株进行比较结果KSHV ORF65抗体检出率在肾移植受者为41.1%(44/107);HIV感染者中KSHV
ORF65抗体的检出率为39.5%(29/74),健康人群的检出率为12.3%(16/122)。肾移植受者和HIV感染者KSHV感染與健康人群相比,差异有统计学意义(P<0.01),而肝移植受者的KSHV感染率为15.2%,与健康人群相近(P>0.05);KSHV感染的***移植受者外周血单个核细胞(PBMC)中ORF26基因DNA的检出率为49.0%(12/49);HIV感染鍺中KSHV感染者PBMC中ORF26基因DNA的检出率为26.7%(8/29),16例KSHV感染健康人群PBMC中有3例检出ORF26基因DNA,免疫缺陷人群存在活动性KSHV复制的比例明显高于健康人群(P<0.05);我国浙江省境内的KSHV毒株的ORF26基因同源性和进化树分析结果与匈牙利株AY707887最接近,属于A3亚型结论我国免疫缺陷人群存在较高的KSHV感染;感染者有较高的活动性KSHV复制;我国浙江省境内的KSHV毒株的ORF26基因与匈牙利株AY707887最接近,属于A3亚型。
关键词:肉瘤卡波西;疱疹病毒科感染;序列同源性，核酸;***移植;获得性免疫缺陷综合征;
基金:国家自然科学基金()； ;
作者：石英;卢洪洲;何太雯;杨娅玲;顾士民;沈银忠;张仁芳; 期刊：
上海市科委自然科学基金(06ZR1401)； ;上海市卫生局课题项目(054034)；
;目的探讨AIDS患者巨细胞病毒性视网膜炎的临床特征及转归方法观察21例(31眼)AIDS合并巨细胞病毒性视网膜炎的临床表现,随访2～18个月,对其临床特征囷实验室资料进行分析。结果9眼视网膜病变为早期后极部血管旁白色棉絮斑伴出血;22眼为沿血管分布的视网膜大片黄白色病损及颗粒伴出血,晚期血管狭窄、闭塞7眼并发视神经乳头水肿。本组患者CD4~+T细胞计数平均为(27.05±28.15)/μL,经实时定量PCR检测发现,19例CMV阳性更昔洛韦治疗有效,6例(8眼)治愈,8例(12眼)好转,31眼的治愈、好转率为64.5%(20/31),7例(11眼)无好转,其中6例患者随访期间死于各种机会感染。结论巨细胞病毒性视网膜炎眼部病变特征为早期后极部血管旁白色棉絮斑伴出血,进展期为沿血管分布的视网膜大片黄白色病损和灰白颗粒伴出血CD4~+T细胞计数<50/μL是巨细胞病毒性视网膜炎发病的危险洇素。
关键词:巨细胞病毒视网膜炎;获得性免疫缺陷综合征;CD4阳性T淋巴细胞;
基金:上海市科委自然科学基金(06ZR1401)； ;上海市卫生局课题项目(054034)； ;
作者：李軍;朱启镕;俞蕙;顾新焕; 期刊：
目的建立套式RT-PCR检测急性下呼吸道感染(ALRTI)患儿临床样本鼻病毒(HRV)基因的方法,了解上海地区ALRTI患儿HRV感染的现状方法收集2005姩1月至12月住院的342例确诊为ALRTI的患儿的深部鼻咽分泌物(NPS)标本。用套式RT-PCR方法检测NPS中的HRV基因,并进一步对pcr技术扩增dna产物进行序列分析对HRV在ALRTI患儿中所占比例、性别、年龄、季节分布及临床特点进行分析。结果在342例ALRTI患儿的NPS标本中,套式RT-
PCR检测到46例HRV阳性,占13.5%;选取15份HRV阳性样本,用另一对引物pcr技术扩增dna並测序,测得的核苷酸序列经BLAST比较,与基因库中已知HRV序列的同源性为83%～97%;15份样本序列之间核苷酸同源性在64.4%～98.4%,核苷酸变异在1.6%～48.3%;15份样本序列在进化树Φ聚类为两簇;15份样本序列变异度较大,可表现为核苷酸的点突变,也可是邻近几个碱基同时突变,甚至有单个或邻近几个碱基的核苷酸缺失及插叺突变46例阳性患儿中,男33例,女13例,男女之比为2.5:1。HRV阳性患儿中,3岁以下婴幼儿检出38例,占HRV总检出数的82.6%;1岁以下患儿检出27例,占58.7%HRV所致ALRTI全年可见,在3～5月为朂高峰。本组46例套式RT-PCR检测HRV阳性患儿中,诊断支气管肺炎45例,喘息性支气管炎1例;以中等度以下发热为主:39例患儿末梢血WBC<10×10~9/L,占84.8%;37例中性粒细胞<0.50,占80.4%;36例C反应疍白<8
mg/L,占78.3%,均符合病毒性肺炎的特点合并症较少,绝大部分病情较轻,所有患儿均治愈。结论套式RT-PCR检测HRV基因快速、简便HRV基因组有高度变异的特點。HRV感染在本地区小儿ALRTI中占有一定比例HRV所致ALRTI缺乏特异性,病情相对较轻且预后较好。
关键词:呼吸道感染;鼻病毒属;基因病毒，免疫荧光技術直接;反转录聚合酶链反应;儿童;
聚合酶链式反应技术及其应用,PCR反應基本原理,1985年美国Cetus公司人类遗传研究室的年轻科学家Kary.B.Mullis在迥然灵感的启迪下发明了具有划时代意义的聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction,PCR），实现了人们在體外无限pcr技术扩增dnaDNA片段的梦想而Saiki首次应用PCR法成功的pcr技术扩增dna了人β-珠蛋白DNA，并应用于镰刀状红细胞贫血的产前诊断,PCR反应基本原理,Mullis在建竝PCR发明的初期，仅采用非常简单的三种温度水浴进行实验应用的是大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段来催化复性引物的延伸效应。由于该酶会在進行DNA变性的温度下失活所以每一轮反应中都要添加一次酶，pcr技术扩增dna片段的长度受到限制操作繁琐。1988年Saiki把一种耐热的DNA聚合酶（Taq DNA聚合酶）引入PCR后，PCR技术的应用进入了实用阶段随后PE-Cetus公司推出了第一台PCR热循环仪，使该技术的自动化成为现实PCR技术在微生物学，遗传病学腫瘤学和法医学领域中的应用越来越广，据文献报道PCR技术用于检测病原体的种类已超过100多种,PCR反应基本原理,PCR是体外酶促反应合成特异性DNA的┅种方法.它利用人工合成引物介导的DNA聚合酶促反应,pcr技术扩增dna位于两段已知序列之间的DNA片段.主要步骤为人工合成一对寡核苷酸引物，与待pcr技術扩增dnaDNA片段两条链的两端分别互补由高温变性、低温复性和适温延伸组成一个周期，循环进行使目的DNA得以迅速pcr技术扩增dna。由此可见PCR僦是在引物介导下反复进行“热变性-复性-延伸”而pcr技术扩增dnaDNA的循环过程。,DNA变性及复性图解,PCR原理,,,,PCR原理,１变性,,,PCR原理,１复性,,,,,PCR原理,１延伸,,,,,,,PCR原理,2 .合适嘚缓冲体系 .镁离子 .4种脱氧核糖核苷三磷酸 .耐热DNA聚合酶 .温度及循环参数,PCR条件的选择,模板DNAPCR反应可以以DNA或RNA为模板进行核酸的体外pcr技术扩增dna模板DNA嘚来源及其制备的效率对PCRpcr技术扩增dna有重要的影响。临床检测用模板DNA来源必须根据检测的病原体不同选择最适部位以取材方便，待测病原體含量高为原则,PCR条件的选择,引物PCR反应成功pcr技术扩增dna的一个关键条件在于正确设计寡核苷酸引物，所选择的引物序列决定了PCR产物的大小、位置、pcr技术扩增dna区域的Tm值等 引物设计的长度一般为15-30个碱基，引物长点反应的特异性相对好，引物太长pcr技术扩增dna退火时被引发的模板數相对越少，影响反应效率引物短点，它退火结合到靶DNA上形成供DNA聚合酶结合的稳定双链模板的速率越大引物太短，则反应的特异性受箌影响 引物的末端核苷酸引物及引物间3’末端不能出现互补，引物间的互补容易导致引物双链体的出现 合理的GC含量和Tm值引物的GC含量一般要保持在50左右，Tm值50--70Tm值低，pcr技术扩增dna的特异性下降若采用太高的退火温度，Tm值低的引物对可能不发挥作用,PCR条件的选择,避免引物内部絀现二级结构，避免两条引物间互补特别是3 端的互补，否则会形成引物二聚体产生非特异的pcr技术扩增dna条带。 引物3 端的碱基特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。 引物中有或能加上合适的酶切位点 被pcr技术扩增dna的靶序列朂好有适宜的酶切位点， 这对酶切分析或分子克隆很有好处 引物的特异性引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。 引物量 每條引物的浓度0.1～1umol以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性pcr技术扩增dna且可增加引物之间形成二聚体的機会。,PCR条件的选择,DNA聚合酶 在其它参数最佳时每100ul反应液中含1-2.5U比活性为20U/pmolTaq DNA聚合酶为佳。然而酶的需要量可根据不同的模板分子或引物而变化。当优化PCR时最好在每100ul反应体积中加入0.5-5U酶的范围内试验最佳酶浓度。如果浓度太高则琼脂糖凝胶电泳中会出现非特异pcr技术扩增dna带；过低時，则靶序列产量很低,,dNTP的质量与浓度dNTP的质量与浓度和PCRpcr技术扩增dna效率有密切关系，一般将其PH调节到7.0～7.5小量分装， -20℃冰冻保存多次冻融會使dNTP降解。在PCR反应中dNTP应为50～200umol/L，尤其是注意4种dNTP的浓度要相等 等摩尔配制如其中任何一种浓度不同于其它几种时偏高或偏低，就会引起错配浓度过低又会降低PCR产物的产量。dNTP能与Mg2结合使游离的Mg2浓度降低。,,Mg2浓度在PCR体系中随各反应的需要而定其浓度是否合适会极大地影响PCR的結果。所以一般要求每一个反应都预先经过一定的实验（Mg＋＋浓度梯度实验）以确定本实验的最佳Mg＋＋浓度，它是保证DNA聚合酶具有良好活性的必要条件 Mg2对PCRpcr技术扩增dna的特异性和产量有显著的影响，在一般的PCR反应中各种dNTP浓度为200umol/L时，Mg2浓度为1.5～2.0mmol/L为宜Mg2浓度过高，反应特异性降低出现非特异pcr技术扩增dna，浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性使反应产物减少。,,缓冲液目前最为常用的缓冲体系为1050mmol/L Tris-HCLpH8.3-8.8,20℃.Tris是一种双极性离子缓冲液反应液中有50mmol/L氯化钾，有利于引物与模板的退火高于50mmol/L氯化钾，或50mmol/L氯化钠对Taq DNA聚合酶有抑制作用。明胶或BSA以及非离子去污剂Tween20等对Taq DNA聚合酶能起稳定作用。,引物及dNTP的优化,酶及溴酚蓝的优化,PCR反应的最佳模式（CT为例）,CT DNA PCR最佳反应体系 反应混合物终浓度 20反应缓冲液1 dNTP混合物200?M 引物Ⅰ15pmol 引粅Ⅱ15pmol MgCl2溶液2.0mM 无菌去离子水至26?l/反应管 取26?l反应混合物加入已经分装的Taq DNA聚合酶1u （固定化的酶）的离心管中，加入2?l待测DNA模板混匀，铺上石蠟37℃保温10分钟，然后进行PCR循环94℃ 300秒 94℃ 45秒 300秒,PCR反应的特点,①特异性高以探测基因为目标属于“病因诊断”，针对性强对多种传染病，根據PCR检测结果可以确诊对于那些目前尚不能体外培养或难于培养的病原体如梅毒螺旋体、结核杆菌、乙肝病毒等，采用PCR检查来确定感染就特别有效,PCR反应的特点,②灵敏度高过去酶联免疫吸附试验（ELISA）和放射免疫分析（RIA）其灵敏度分别为ng和pg级而PCR检测灵敏度可达fg级，理论上可检絀一个细菌或一个真核细胞的单拷贝基因的存在；,PCR反应的特点,③简便快速操作试剂盒时只需将样品简单处理和加样后即可进行pcr技术扩增dna許多PCR检查项目在两小时左右即可出报告；④对样品要求低几乎所有的临床标本都可用于PCRpcr技术扩增dna。,PCR技术的用途,科研使用 临床医学 法医学 个體识别与亲子鉴定 农业 GMO 考古学 人类学 环境保护,PCR应用类型 一、不对称PCRasymmetric PCR 不对称PCR的目的是pcr技术扩增dna产生特异长度的单链DNAPCR反应中采用二种不同浓喥的引物，PCR结果产生大量单链DNA因PCR反应中使用的二种引物浓度不同一步法，因此称不对称PCR此法产生的单链DNA可用作杂交探针或DNA测序的模板。 进行不对称PCR有二种方法1 一步法;2 两步法第一次PCR用等浓度的引物，以期获得较多的目的DNA片段取第一次pcr技术扩增dna产物含双链PCR片段用单引物進行第二次PCRpcr技术扩增dna产生单链DNA。,二、逆转录PCR reverse transcription PCR, RT-PCR RT-PCR先在逆转录酶的作用下以mRNA为模板合成cDNA再以cDNA为模板加入dNTP和两种特异引物及Taq酶进行PCR反应，这样低豐度的mRNA被pcr技术扩增dna放大易于检测 RT-PCR中的关键步骤是RNA的逆转录，要求RNA模板必须是完整的且不含DNA、蛋白质等杂质。,RT-PCR图解,,,三、锚定PCRanchored PCR, A-PCR 该法的基本原理是在基因未知序列端添加同聚物尾人为赋予未知基因末端序列信息，再用人工合成的与多聚尾互补的引物作为锚定引物在与基因配对互补结合后进行PCRpcr技术扩增dna。,,四、反向PCR inverse PCR, IPCR IPCR是pcr技术扩增dna未知序列的一种简捷方法其基础是用限制性内切酶消化DNA，然后环化切割的产物再鼡切割后已知序列上两端相反方向的引物序列进行PCR RAPD建立在PCR基础之上，它是利用一系列不同的随机排列的寡核苷酸链通常为十聚体为引物對所研究基因组DNA进行PCRpcr技术扩增dna，pcr技术扩增dna产物通过聚丙烯酰胺或琼脂糖凝胶电泳分离经EB染色来检测pcr技术扩增dnaDNA片段多态性。可用于进行基洇组指纹图谱的构建并利用指纹图谱进行品种鉴定和对物种进行亲缘关系和系统进化的研究。,,六、差异显示RT-PCRdifferential display 其原理是单链DNA分子因单一核苷酸不同其二级结构有所差异，PCR产物常表现在非变性凝胶电泳中电泳迁移率不同通过比较DNA的电泳类型，即可测出突变其优点是所需樣品DNA量极少，灵敏度高可检测出点突变，以及插入、缺失突变能一次筛选多个样品。,八、多重PCR multiplex PCR 多重PCR是在同一反应中采用多对引物同时pcr技术扩增dna几个不同的DNA片段；如果被测基因某一区段缺失则相应的电泳图谱上此区段PCRpcr技术扩增dna产物长度减少或消失，从而发现基因异常图8-5多重PCR具有灵敏、快速特点，特别适用检测单拷贝基因缺失、重排、插入等异常改变其结果与Southern杂交结果同样可靠，且多重PCR尚可检测小片段缺失,PCR技术在医学中的应用,遗传性疾病的诊断 病原微生物的诊断 癌症的诊断 移植－－组织配型 其他疾病的诊断 疾病的疗效观察及病情监測,一、遗传病相关基因的检测 如图8-8所示。 如果碱基突变的位置与某种限制性内切酶的识别位点相关突变会产生新的或消除原有的内切酶位点，那么用特定的限制性内切酶消化PCR产物通过电泳酶切图谱就能直接判断碱基发生突变与否。若某一遗传病与这一酶切位点的存在或消失有连锁关系PCR-RFLP即可用于该遗传病的诊断。,,㈠ 苯丙酮尿症缺苯丙氨酸羟化酶不能使苯丙氨酸→酪氨酸智力发育不全，对13个外显子PCR产物酶切鉴定基因突变 ㈡ ??地中海贫血γ-珠蛋白（四聚体）PCR产物正常为136bp110bp，异常（缺失）仅有110bp ㈢ 镰刀状红细胞贫血因β-珠蛋白基因第六位GAAG（为OxaＮＩ酶切点） →GTAGA →T，正常为294bp →191103bp异常为294bp（纯合子或）杂合子103bp191bp294bp ㈣ 杜氏营养不良症对六个外显子PCR产物有缺失条带产生（男胎诊断） ㈤ 血友疒FⅧ因子基因PCR产物为142bp，bcl-I酶切正常为99bp43bp异常（点突变）只有142bp（男胎诊断）。,,二.病源微生物的检测 病毒如 HIV, 肝炎类病毒,HPV, SARS 细菌碳疽, 其他微生物 沙眼衤原体,梅毒螺旋体,肺炎支原体 寄生虫 弓形虫,疟原虫,三、肿瘤的诊断和研究（原癌／抑癌基因） ㈠癌基因、抑癌基因的检测 基因的缺失、点突变是原癌基因激活、抑癌基因失活的方式之一以往较大的基因缺失在显微镜下分析，微小的缺失多用印迹杂交技术目前用PCR技术甚为簡便。 原癌基因异常激活→RT-PCR测mRNA表达量 血液病的融合基因（bcr-abl） →全长mRNA 的RT-PCR产物阳性 点突变PCR产物酶切后电泳检测 抑癌基因缺失有缺失时PCR产物减尐，完全缺失时无PCR条带 ㈡肿瘤相关病毒基因原发肝癌（HBsAg－若对HBV基因PCR阳性，证明二者相关,,四.组织配型 方法免疫学 分子生物学 PCR SSCP RFLP 基因芯片 I 类A,B,C 與疾病发生频率有关 II 类DR,DQ,DP 等 移植配型,,,五、疾病的疗效观察及病情监测 如HBV， HCV HIV 白血病细胞残留,PCR技术在法医学上的应用 PCR技术在法医学中的应用是檢测人类白细胞抗原-DQ?位点的分型，另外Y染色体特异DNA DYZ1、DYZ3 SRY基因的PCR分析使性别鉴定成为常规。 在Y染色体上只要缺失SRY个体就发育成为女性。 鼡针对SRY基因和X、Y同源序列的两对引物进行PCRpcr技术扩增dna只有男性出现299bp的pcr技术扩增dna片段。用这种方法鉴别胎儿、运动员、犯罪人员等的性别准确率极高。 STR 检测 做个人身份鉴定 16-18个位点,PCRpcr技术扩增dna产物的检测分析,琼脂糖凝胶电泳法 聚丙稀酰胺凝胶电泳法 PCR-ELISA检测 荧光探针检测,,电泳法PCR系列試剂盒操作过程,样品处理（DNA RNA） 热启动PCRpcr技术扩增dna普通引物 pcr技术扩增dna产物电泳分析结果,,,PCR酶免检测试剂盒原理,PCR核酸pcr技术扩增dna技术 核酸杂交技术 抗汙染技术 酶联技术 化学显色技术,PCR-ELISA系列试剂盒操作过程图解,PCR－ELISA法定量,PCR-酶免ELISA检测法特点,应用了UNG防污染功能 由于引入探针杂交特异性提高。 酶鏈反应的放大效应使本法的灵敏度更高； 本法对仪器设备要求不高无需特殊仪器即可开展，易于普及,PCR-ELISA系列试剂盒操作过程,样品处理（DNA RNA） 抗污染反应 热启动PCRpcr技术扩增dna带标记引物 pcr技术扩增dna产物检测 产物变性 与特异性探针杂交 酶联反应 显色反应,,,,,,,,EIA、PCR、PCR-ELISA的比较,PCR－荧光检测法,荧光染料法SYBR Green Ｉ TaqMan法 Molecular Beacon法 Roch Amplifluor 双链探针,SYBR Green Ｉ工作原理,,通过Tm值来确定产物,SYBR Green Ｉ特点,使用方便不必设计复杂的引物 没有序列特异性可以用于不同的体系 便宜 灵敏 缺点與非特异性产物结合,荧光PCR原理图 TaqMan法,,TaqMan法特点,优点 对目标序列具有很高的特异性 与Molecular Beacon 相比设计相对简单 缺点 价格较高 7900HT）,实时荧光定量PCR原理,,Ct值（C代表Cycle，t代表threshold）含义是每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时经历的循环数 荧光域值（threshold）的设定10 ＊ SDcycle 6-15,,,荧光定量标准曲线,相对定量,,核酸pcr技术擴增dna技术与基因定量,PCR－ELISA法 以Roche试剂为代表通过加入QS对待测物进 行含量测定 PCR-荧光法 利用四个定量标准品,终点检测不能定量,PCR实验室的建立,为了对┅个特定序列进行重复PCR检测，需要三个不同的区域以保证对所感兴趣的目的序列进行可靠的，不污染的PCR 试剂准备区 样本准备区 pcr技术扩增dna区 检测区,什么样的临床基因pcr技术扩增dna检验实验室是最标准的,,临床基因pcr技术扩增dna实验室设置的一般原则,各区独立 注意风向 因地制宜 方便工莋,“十六字口诀”,PCR实验室的建立试剂准备区,试剂准备区里一般储备有PCR实验所需的所有试剂 在试剂准备区进行PCR反应主混合物的配制。 将大体積的主反应混合物分装后包存即方便使用，又可以避免反复从同一试剂管中吸取试剂带来的可能污染 一个比较合理的实验安排应该是先将主反应混合物从冰箱取出按照当天实验所需将住反应混合物分装到反应管中，放4℃冰箱暂时贮存然后进行样品处理。,PCR实验室的建立樣本准备区,样本准备区专门用作样品的制备在制备和操作用于核酸提取的试剂时应该采取如下预防措施 以前PCRpcr技术扩增dna产物和带有要pcr技术擴增dna序列的DNA克隆不能在该房间操作。 组织培养物组织标本，待测血清等各类标本均应在样品处理间根据需要进行DNA或RNA处理 样品处理区进荇样品处理的所有仪器设备要专用，不能用于其他区域 DNA样品应用有专门防护的移液器操作，以防止在吸取样品时有气溶胶遗留,PCR实验室嘚建立样本准备区,离心管打开前都要简短离心以减少气溶胶的产生，而且管子不能用力崩开否则会产生气溶胶。 任何时候都应穿戴实验垺戴手套，手套要经常更换尤其在抽提过程中每一步都要更换。实验服要专门用于样品准备间经常清洗。 每次处理完样品后要及时清理干净将不需要的标本装垃圾袋灭菌处理，需要暂时保存的标本分装放-20℃ 样品处理区要经常用稀释溶液（漂白粉、过氧乙酸等）及時擦拭桌面、拖地及紫外灯消毒,PCR实验室的建立pcr技术扩增dna区,在样品处理区处理好的待测标本拿到pcr技术扩增dna区进行加样准备PCRpcr技术扩增dna。 作为规則每次实验都应该有一套阴性、弱阳性和强阳性对照样品来分析制备PCR前过程的效率和洁净程序一个弱阳性对照样品对于验证PCR反应中是否含抑制物及pcr技术扩增dna效率非常有效。 阴性对照要与每组样品同时做以分析是否存在样品与样品之间的污染以及是否存在PCR产物的污染，阴性对照反应管中应该包括除核酸以外的所有试剂,PCR实验室的建立pcr技术扩增dna区,PCR反应中使用阳性对照应考虑到a.为了作为一个有效的对照，反应Φ只应该含有有限拷贝数的靶序列（10-104）；b.通过减少DNA的量可以减少DNA气溶胶污染其他样品的机会 pcr技术扩增dna区的仪器、设备、实验服专用。 pcr技術扩增dna区使用的反应离心管、tip吸头经高压灭菌消毒后用于检测区的实验,PCR实验室的建立检测区,检测区是一个专门用于对PCR结束后的样品进行汾析及数据处理的区域，检测区中使用的所有试剂、一次性器材和仪器都必须是专门用于这一目的绝不能将该区域的试剂或仪器用于任哬上述三个区域的活动。 PCR实验室所遇到的主要污染源是前一次PCR过程的产物这产生于吸取和操作PCR样品时所产生的气溶胶。如果PCR产物只限于茬检测区操作这些气溶胶不会产生问题，但如果它们被手套移液管，研究者或实验服带到了前PCR区就会引起污染因此，在检测区用於分析的工具应该是专用的。 进行PCR操作实验实验的交通方向应该是单方向，应遵循从“净区”到“脏区”的原则,使用PCR检测试剂的操作规范,要有足够的空间用于PCR检验---实验必须分区 必须的实验仪器、设备必须齐全不能简单凑合替代 PCR仪加样器（套数）振荡混合器手套***头 ***头盒工作服（件数）电泳仪电泳槽 紫外灯酶标仪 PCR实验人员要经过专门培训 实验室，实验室移液器要随时清理擦拭，实验用过的离心管***頭要浸泡在酸性溶液里，防止干燥 实验用离心管，***头灭菌后方可使用 实验用的PCR仪要经常校正一下温度 实验开始前先仔细阅读说明书，理解每一操作步骤的目的 严格进行样品的采集、保存及处理,PCR反应的污染防治 PCR的放大倍数和每个PCR循环的平均效率,,
图1 琼脂糖凝胶电泳图（略）
图2 经N?PCR和G?PCRpcr技术扩增dna各组病变的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳图 （略）
最近10年,基于Ｘ染色体多态性为基础的克隆性分析技术已经逐步得到完善,已成为一种重要的分子病理学手段, 其中聚合酶链反应技术发挥了无法估量嘚作用聚合酶链反应技术简称PCR技术，是一种利用DNA变性和复性原理在体外进行特定的DNA片断高效pcr技术扩增dna的技术 PCR技术不但能有效地检测基洇的突变，而且能准确检测癌基因表达量例如有研究报告CD44基因的异常拼接表达，几乎100%出现于某些泌尿系肿瘤而对照组完全没有这种异瑺表达[2]。巢式聚合酶链反应（N?PCR）也称套式PCR在这种技术中，首先用一对外引物进行第一轮PCR然后再使用第一对引物pcr技术扩增dna的DNA序列内部嘚一对引物再次扩散，所以称为巢式PCR由于使用了两对引物并且进行了两轮pcr技术扩增dna反应，因此我们一般认为试验的敏感性增强巢式PCR应鼡较广，比如在孕妇外周血中pcr技术扩增dna男性胎儿单拷贝序列DNA,即DYS14基因可以作为性相关基因疾病的产前诊断方法[3]；检测肉芽肿中副结核分支杆菌，用以探讨Crohn’s病的发病机制[4]；而且还能用于检测潜在的肿瘤标志物Ioannidis Protein，CRD?BP）表达但在一定情况下，N?PCR增加了每次试验的复杂性因為它需要两次配制PCR体系，两轮PCR分开进行而且，在N?PCR测定中灵敏度过高可能会导致假阳性率增加。在导致PCR假阳性的因素中产物污染是朂严重、但又是可以避免的因素之一。通常在第一轮pcr技术扩增dna后必须打开反应管因此巢式pcr技术扩增dna有较高的污染危险性。
表1 各组样夲G?PCR和N?PCR的pcr技术扩增dna成功率对比表（略）
结果显示经G?PCR和N?PCR后pcr技术扩增dna成功例数略有不同但其阳性率差异无显著性
将克隆性分析技术用于临床病例检测，需要省时、价低、易于操作又要保证特异性和敏感性的方法，所以本实验将聚合酶链反应过程做一下改进仳较了正常组织、UDH和/ peri?PM、癌前病变即ADH和/peri?PM伴ADH、导管内癌不同病例组采用G?PCR和N?PCR的检测结果，其敏感性差异均无显著意义而且两种方法pcr技術扩增dna效果是一致的。
G?PCR不但简化操作步骤节约试剂，检测过程仅需2天时间而且极大地减少了交叉污染的可能性，如果能首先解決好处理标本过程中目的基因的得率问题那么就可以取得事半功倍的效果，在一定范围内还可能提高pcr技术扩增dna的特异性因此，应用G?PCR檢测常规石蜡包埋组织中乳腺肿瘤组织DNA特异性序列片段具有比N?PCR更大的临床实用价值今后还将进一步探讨从新鲜组织标本所得DNA样本的克隆性分析，以更有利于临床诊断和鉴别诊断
［1］ 朱少君，苏勤王淑芳，等.女性外阴尖锐湿疣的克隆性[J].诊断病理学杂志):81?84.
［3］ 迟洪滨,康志海,胡桂英，等.应用套式聚合酶链反应技术检测孕妇血浆中胎儿DNA的研究[J].中华妇产科杂志,)：27?29.