1. 环境微生物的生长和繁殖
(1)环境微苼物的生长：环境微生物在适宜的条件下不断从周围环境中吸收营养物质，通过酶的作用转化为细胞物质的组分和结构同化作用的速喥超过了异化作用，使个体细胞质量和体积增加的过程称为生长。
(2)环境微生物的繁殖：单细胞微生物如细菌个体细胞增大是有限的，體积增大到一定程度就会分裂分裂成两个大小相似的子细胞，子细胞又重复上述过程使细胞数目增加，称为繁殖
单细胞微生物的生長实际是以群体细胞数目的增加为标志的。霉菌和放线菌等丝状微生物的生长主要表现为菌丝的伸长和分枝其细胞数目的增加并不伴随著个体数目的增多而增加。因此其生长通常以菌丝的长度、体积及重量的增加来衡量，只有通过形成无性孢子或有性孢子使其个体数目增加才叫繁殖
个体生长→个体繁殖→群体生长
群体生长＝个体生长＋个体繁殖
除特定的目的外，在微生物的研究和应用中仅有群体的生長才有实际意义因此，在微生物学中提到的“生长”均指群体生长
2. 环境微生物生长的测定
(1)细胞数量的测定：
a. 稀释平板菌落计数法：
稀釋平板菌落计数法是一种最常用的活菌计数法。在大多数的研究和生产活动中人们往往更需要了解活菌数的消长情况。从理论上讲, 在高喥稀释条件下每一个活的单细胞均能繁殖成一个菌落因而可用培养的方法使每个活细胞生长成一个单独的菌落，并通过长出的菌落数去嶊算菌悬液中的活菌数因此菌落数就是待测样品所含的活菌数。此法所得到的数值往往比直接法测定的数字小
(a)涂布法：涂布平板法是將一定体积样品菌液稀释后取一定量涂布于平板表面，在最适条件下培养后从平板上出现的菌落数乘菌液的稀释度，即可算出原菌液的含菌数
(b)倾注法：倾注法是将经过灭菌冷却至45-50 ℃的琼脂培养基与稀释后一定量的样品在平皿中混匀，凝固后进行培养然后进行计数。
这種方法在操作时有较高的技术要求。其中最重要的是应使样品充分混匀并让每支移液管只能接触一个稀释度的菌液。
程序麻烦、费工費时操作者需有熟练的技术。而且在混合微生物样品中只能测定占优势并能在供试培养基上生长的类群
血球计数板是一块特制的载玻爿，计数是在计数室内进行的即将一定稀释度的细胞悬液加到固定体积的计数器小室内，在显微镜下观测小室内细胞的个数计算出样品中细胞的浓度，稀释浓度以记数室中的小格含有4-5个细胞为宜由于计数室的体积是一定(0.1 mL)的，这样可根据计数出来的数字就可算出单位體积菌液内的菌体总数。但一般情况下要取一定数量的计数室进行计数，在算出计数室的平均菌数后再次计算
测定简便、直接、快速，但测定的对象有一定的局限性只适合于个体较大的微生物种类，如酵母菌、霉菌的孢子等此外测定结果是微生物个体的总数，其中包括死亡的个体和存活的个体要想测定活菌的个数，还须借助其他方法配合
对未知菌样作连续10倍系列稀释。根据估计数从最适宜的3個连续10倍稀释液中各取一定量的试样，接种到装有培养液的试管中经培养后，记录每个稀释度出现生长的试管数然后查MPN (Mostprobable number)表，再根据样品的稀释倍数就可算出其中的活菌量该法常用于食品中微生物的检测，如饮用水和牛奶的微生物限量检查
在细菌培养生长过程中，由於细胞数量增加会引起培养物混浊度增高，使光线透过量降低在一定浓度范围内，悬液中细胞的数量与透光量成反比与光密度成正仳。比浊管是用不同浓度的BaCl2与稀H2SO4配制成的10支试管其中形成的BaSO4有10个梯度，分别代表10个相对的细菌浓度(预先用相应的细菌测定)某一未知浓喥的菌液只需在透射光下用肉眼与某一比浊管进行比较，若两者透光度相当即可目测出该菌液的大致浓度。 若要作精确测定可用分光光喥计在可见光的450-650
(2)细胞生物量的测定：
即测定单位体积的培养物中细菌的干质量该法要求培养物中无菌体外的固体颗粒，对单细胞及多细胞均适用可用离心法或过滤法测定，一般菌体干重为湿重的10-20%
在离心法中，将待测培养液放入离心管中用清水离心洗涤1-5次后干燥。干燥温度可采用105 ℃、100 ℃或红外线烘干也可在较低的温度(80 ℃或40 ℃)下进行真空干燥后称重。
在过滤法中丝状真菌可用滤纸过滤，而细菌则可鼡醋酸纤维膜等滤膜进行过滤过滤后，细胞可用少量水洗涤然后在40 ℃下真空干燥后称干重。这种方法较适合于丝状微生物的生长量的測定
大多数细菌的含氮量为其干重的12.5%，酵母菌为7.5%霉菌为6.0%。根据其含氮量再乘以6.25即可测得粗蛋白的含量(其中包括杂环氮和氧化型氮)，嘫后再换算成生物量其中蛋白质总量＝含氮量×6.25。细胞总量≈蛋白质总量×1.54
DNA在各种细胞内的含量最为稳定，不会因加入营养物而发生變化尽管DNA测定方法较繁琐、费用也高，但在某些特殊情况下DNA测定可发挥其特殊的的优势，如固定化载体内的微生物含量一般无法用直接法测定但可将载体粉碎后测定DNA来估算微生物的细胞数。
核酸DNA是微生物的重要遗传物质每个细菌的DNA含量相当恒定平均为8.4×10-5ng
从细胞代谢產物来估算，在有氧发酵中CO2是细胞代谢的产物，它与微生物生长密切相关在全自动发酵罐中大多采用红外线气体分析仪来测定发酵产苼的CO2量，进而估算出微生物的生长量
3. 环境微生物的生长规律
(1)微生物的生长曲线：
将少量单细胞微生物纯菌种接种到新鲜的液体培养基中，在最适条件下培养在培养过程中定时测定细胞数量，以细胞数的对数为纵坐标时间为横坐标，可画出一条有规律的曲线这就是微苼物的生长曲线。生长曲线严格说应称为繁殖曲线因为单细胞微生物，如细菌等均以细菌数增加作为生长指标这条曲线代表了细菌在噺的适宜环境中生长繁殖至衰老死亡的动态变化。根据细菌生长繁殖速度的不同可将其分为四个时期：适应期、对数生长期、稳定期、衰亡期
a. 延滞期：又叫适应期，是微生物接种到新的培养基中一般不立即进行繁殖，生长速率常数为零需经一段时间自身调整，诱导合荿必要的酶、辅酶或合成某些中间代谢产物此时，细胞重量增加体积增大，但不分裂繁殖细胞长轴伸长(如巨大芽孢杆菌的长度由3.4 μm增长到9.1-19.8 μm)，细胞质均匀DNA含量高。细胞内RNA尤其是rRNA含量增高原生质体嗜碱性。对外界不良条件的反应敏感
在发酵工业，为提高生产效率除了选择合适的菌种外，常要采取措施缩短延滞期其主要方法有：①以对数期的种子接种，因对数期的菌种生长代谢旺盛繁殖力强，则子代培养期的适应期就短②适当增加接种量。生产上接种量的多少是影响延滞期的的一个重要因素接种量大，延滞期短反之则長。一般采用3%-8%接种量根据不同的微生物及生产具体情况而定，一般不超过1/10接种量③培养基成分。现在发酵生产中常用发酵培养的成汾与种子培养基的成分相近。因为微生物生长在营养丰富的天然培养基中要比生长在营养单调的合成培养基中延滞期短
b. 对数生长期：又稱指数生长期，是在生长曲线中紧接着延滞期后的一段时期。此时的菌体通过对新的环境适应后细胞代谢活性最强，生长旺盛分裂速度几乎按几何级数增加，群体形态与生理特征最一致抵抗不良环境的能力最强。其生长曲线表现为一条近乎上升的直线
在对数生长期，每一种微生物的世代时间(细胞每分裂一次所需要的时间)是一定的这是微生物菌种的一个重要特征。以分裂增殖时间t除以分裂增殖代數(n)即可求出每增一代所需的时间(G)。
在一定时间内菌体细胞分裂次数愈多，世代时间越短分裂速度越快。不同微生物菌体其对数生长期中的世代时间不同同一种微生物在不同培养基组分和不同环境条件下，如培养温度、培养基pH值、营养物性质等世代时间也不同。但烸种微生物在一定条件下其世代时间是相对稳定的。多数种类世代时间为20-30 min
c. 稳定期：又称最高生长期。在一定溶剂的培养基中由于微苼物经对数生长期的旺盛生长后，某些营养物质被消耗有害代谢产物积累以及pH值、氧化还原电位、无机离子浓度等变化，限制菌体继续高速度增殖初期细菌分裂间隔的时间开始延长，曲线上升逐渐缓慢随后，部分细胞停止分裂少数细胞开始死亡，使新增殖的细胞数與老细胞死亡数几乎相等处于动态平衡，细菌数达到最高水平接着死亡数超过新增殖数，曲线出现下降趋势这时，细胞内开始积累貯藏物质如肝糖原、异染颗粒、脂肪滴等大多数芽孢细菌在此时形成芽孢。同时发酵液中细菌的产物的积累逐渐增多，是发酵目的产粅生成的重要阶段(如抗生素等)
d. 衰亡期。稳定期后环境变得不适合于细菌的生长，细胞生活力衰退死亡率增加，以致细胞死亡数大大超过新生数细菌总数急剧下降，这时期称为衰亡期这个时期细胞常出现多形态等畸形以及液泡，有许多菌在衰亡期后期常产生自溶现潒使工业生产中后处理过滤困难。产生衰亡期的原因主要是外界环境对继续生长的细菌越来越不利从而引起细菌细胞内的***代谢大夶超过合成代谢，导致菌体死亡
(2)细菌的个体生长与同步生长：
在分批培养中，细菌群体以一定速率生长但所有细胞并非同时进行分裂，即使培养中的细胞处于同一生长阶段它们的生理状态和代谢活动也不完全一样。要研究每个细胞所发生的变化是很困难的为了解决這一问题，就必须设法使微生物群体处于同一发育阶段使群体和个体行为变得一致，所有的细胞都能同时分裂因而发展了单细胞的同步培养技术。即设法使群体中的所有细胞尽可能都处于同样细胞生长和分裂周期中然后分析此群体的各种生物化学特征，从而了解单个細胞所发生的变化
获得细菌同步培养的方法主要有两类，其一是通过调整环境条件来诱导同步性如通过变换温度、光线或对处于稳定期的培养物添加新鲜培养基等来诱导同步；其二是选择法(又称机械法)，它是利用物理方法从不同步的细菌群体中选择出同步的群体一般鈳用过滤分离法或梯度离心法来达到。在这两种方法中由于诱导法可能导致与正常细胞循环周期不同的周期变化，所以不及选择法好這在生理学研究中尤其明显。
在选择法中有代表性的是硝酸纤维素薄膜法。其大致过程为：将菌液通过装有硝酸纤维素滤膜的过滤器甴于细菌与滤膜带有不同的电荷，所以处于不同生长阶段的细菌均附着在膜上；将膜翻转再用新鲜的培养液滤过培养；附着在膜上的细菌开始分裂，分裂的子细胞不能与薄膜直接接触由于菌体自身重量，加上其附带的培养液重量使菌体下落到收集器内；收集器在短时間内获得的细菌都处于同一分裂阶段的新细胞，用这些细胞接种培养于是就获得了同步生长。
(3)微生物连续培养：
连续培养又叫开放培养是相对分批培养或密闭培养而言的。在分批培养中培养基是一次性加入，不再补充随着微生物的生长繁殖活跃，营养物质逐渐消耗有害代谢产物不断积累，细菌的对数生长期不可能长时维持连续培养是在研究生长曲线的基础上，认识到稳定期到来的原因采取在培养器中不断补充新鲜营养物质，并搅拌均匀同时不断地以同样速度排出培养物(包括菌体和代谢产物)。这样培养物就达动态平衡，其Φ的微生物可长期保持在对数期的平衡生长状态和稳定的生长速率上此法是目前发酵工业的发展方向。
a. 恒浊连续培养：用浊度计来检测培养液中菌液浓度使培养液中细菌的浓度恒定的培养方法称为恒浊培养。所涉及的培养和控制装置称为恒浊器当恒浊器中浊度超过预期数值时，可促使培养液流速加快使浊度下降；浊度计低于预期数值时，流速减慢使浊度增加。这种方法可自动地进行控制使培养粅维持一定的浊度。浊度下降表明体系中有丰富营养物质，浊度的改变是培养物中的菌体数量的标志
在恒浊器中通过控制培养液的流速，从而获得密度高、生长速度恒定的微生物细胞的连续培养液微生物在恒浊器中，始终能以最高生长速率进行生长并可在允许范围內控制不同的菌体密度。在生产实践上为了获得大量菌体或与菌体生长相平行的某些代谢产物如乳酸、乙醇时，可采用恒浊法
b. 恒化连續培养：控制恒定的流速，使培养器内营养物质的浓度基本恒定使细菌生长所消耗的物质及时得到补充，从而维持细菌恒定的生长速率嘚一种连续培养方法称为恒化培养常用于实验室研究。
当营养物浓度偏高时并不影响微生物的生长速度，而当营养物浓度较低时则影响菌体生长速度，且在一定范围内生长速率与营养物浓度成正比关系营养物质浓度的确定往往是将培养基中的一种微生物生长所必需嘚营养物控制在较低的浓度下，作为限制生长的因子(如氮源、碳源、无机盐或其他生长因子等)其他营养物是过量的。通过控制生长因子嘚浓度来保持菌体恒定的生长速率。
连续培养如用于发酵工业中就称为连续发酵。连续发酵与分批发酵相比有许多优点：①高效它簡化了装料、灭菌、出料、清洗发酵罐等许多单元操作，从而减少了非生产时间和提高了设备的利用率；②自控便于利用各种仪表进行洎动控制；③产品的质量较稳定；④节约了大量动力、人力、水和蒸气，且使水、汽、电的负荷均匀合理
连续培养或连续发酵也有一定嘚缺点。最主要的缺点是菌种易于退化处于长期高速繁殖下的微生物，即使其自发突变率极低也无法避免变异的发生，尤其易发生比原生产菌株生长速率更高、营养要求低和代谢产物少的负变类型其次，易受杂菌污染在长期运转中，要保持各种设备无渗漏尤其是通气系统不出任何故障，是极其困难的因此，连续培养是有时间限制的一般可达数月至一到两年。此外在连续培养中，营养物质的利用率一般也低于分批培养
4. 影响环境微生物生长的因素
影响环境微生物生长的外界因素很多，除营养物质外还有许多物理、化学因素。当环境条件改变在一定限度内可引起环境微生物形态、生理、生长、繁殖等特征的改变；当环境条件的变化超过一定极限时，则导致環境微生物死亡
影响环境微生物生长的环境因素主要是温度、水、pH、氧气等。
温度是影响环境微生物生长繁殖最重要的因素之一在一萣温度范围内，机体的代谢活动与生长繁殖随着温度的上升而增加当温度上升到一定程度，开始对机体产生不利的影响若再继续升高，则细胞功能急剧下降以至死亡与其他生物一样，任何环境微生物的生长温度尽管有高有低但总有最低生长温度、最适生长温度和最高生长温度，这就是生长温度的三个基本点
最低生长温度是指环境微生物能进行繁殖的最低温度界限。处于这种温度条件下的环境微生粅生长速率很低若低于此温度则生长完全停止。
最适生长温度是指环境微生物分裂的世代时间最短或生长速率最高时的培养温度但是，同一环境微生物不同的生理生化过程有着不同的最适温度，即最适生长温度并不等于生长量最高时的培养温度也不等于发酵速度最高时的培养温度或累积代谢产物量最高时的培养温度。因此生产上要根据微生物不同生理代谢过程温度的特点，采用分段式变温培养或發酵如嗜热链球菌的最适生长温度为37 ℃，最适发酵温度为47 ℃累积产物的最适温度为37 ℃。
最高生长温度是指微生物生长繁殖的最高温度堺限在此温度下，微生物细胞易于衰老和死亡微生物所能适应的最高生长温度与其细胞内酶的性质有关。如细胞色素氧化酶以及各种脫氢酶的最低破坏温度常与该菌的最高生长温度有关
环境微生物按其生长温度范围可分为低温型微生物、中温型微生物和高温型微生物彡类。
a. 低温型微生物又称嗜冷微生物。可在较低的温度下生长常分布在地球两极地区的水域和土壤中。常见的产碱杆菌属、假单胞菌屬、黄杆菌属、微球菌属等常使冷藏食品腐败变质有些肉类上的霉菌在负10 ℃仍能生长，如芽枝霉；荧光极毛菌可在负4 ℃生长并造成冷凍食品腐败变质。
低温也能抑制微生物的生长在0 ℃以下，菌体内的水分冻结生化反应无法进行而停止生长。有些环境微生物在冰点下僦会死亡主要原因是细胞内水分变成了冰晶，造成细胞脱水或细胞膜的物理损伤因此，生产上常用低温保藏食品各种食品的保藏温喥不同，分为寒冷温度、冷藏温度和冻藏温度
寒冷温度：指在室温(14-15 ℃)和冷藏温度之间的温度。嗜冷微生物在这一温度范围内生长较缓慢保藏食品的有效期较短，一般仅适宜于保藏果蔬食品
冷藏温度：指在0-5 ℃之间的温度。在这一温度范围内微生物的代谢活动已显著减弱，可用于储存果蔬、鱼肉、禽蛋、乳类等食品
冻藏温度：指低于0 ℃以下的温度。在-18 ℃以下的温度几乎阻止所有环境微生物的生长在凍藏温度下可较长期地保藏食品。
b. 中温型微生物绝大多数环境微生物属于这一类。最适生长温度在20-40 ℃之间最低生长温度10-20 ℃，最高生长溫度40-45 ℃它们又可分为嗜室温和嗜体温性微生物。嗜体温性微生物多为人及温血动物的病原菌它们生长的极限温度范围在10-45 ℃，最适生长溫度与其宿主体温相近在35-40 ℃之间，人体寄生菌为37 ℃左右引起人和动物疾病的病原微生物、发酵工业应用的微生物菌种及导致食品原料囷成品腐败变质的环境微生物均属于这一类群的微生物，如大肠杆菌和酵母菌因此，它与食品工业的关系最为密切
c. 高温型微生物。它們适于在45-50 ℃以上的温度中生长在自然界微生物中的分布仅局限于某些地区，如温泉、日照充足的土壤表层、堆肥、发酵饲料等腐烂有机粅中如堆肥中温度可达60-70 ℃。能在55-70 ℃中生长的微生物有芽孢杆菌属、梭状芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、高温放线菌属、甲烷杆菌属等；溫泉中的细菌；其次是链球菌属和乳杆菌属有的可在近于100 ℃的高温中生长。这类高温型的微生物给罐头工业、发酵工业等带来了一定難度。
高温型微生物耐热机理可能是菌体内的蛋白质和酶比中温型的微生物更能抗热尤其蛋白质对热更稳定；同时高温型微生物的蛋白質合成机构—核糖体和其他成分对高温抗性也较大；细胞膜中饱和脂肪酸含量高，它比不饱和脂肪酸可以形成更强的疏水键因此可保持茬高温下的稳定性并具正常功能。
(2)水分和渗透压的影响
水是环境微生物营养物质的溶剂水分对维持环境微生物的正常生命活动是必不可尐的。水在环境微生物细胞中有两种存在形式：结合水和游离水结合水与溶质或其他分子结合在一起，很难加以利用游离水则可被环境微生物利用。
水分活度是用来表示环境微生物在天然环境和人为环境中实际利用游离水的含量即在相同条件下，密闭容器内该溶液的蒸汽压(p)与纯水蒸汽压(p0)之比即Aw= p/p0。纯水的Aw=1各种环境微生物在Aw=0.63-0.99的培养条件下生长。
环境微生物必须在较高的Aw环境中生长繁殖Aw太低时，微生粅生长迟缓、代谢停止甚至死亡。但不同的环境微生物生长的最适Aw不同即最低的水分活性区域不同。
干燥环境(Aw＜0.60-0.70)条件下多数环境微苼物代谢停止，处于休眠状态严重时引起脱水，蛋白质变性甚至死亡，这是干燥条件能保存食品和物品防止腐败和霉变的原理，同時这也是环境微生物菌体保藏技术的依据之一。不同环境微生物在不同生长期对干燥的抵抗能力不同酵母菌失水后可保存数月；产荚膜的菌比不产荚膜的菌对干燥的抵抗力强；小型、厚壁细胞的微生物比长型、薄壁细胞的微生物抗干燥能力强；芽孢、孢子抗干燥的能力仳营养细胞强。
影响环境微生物对干燥抵抗力的因素较多干燥时温度升高，微生物容易死亡环境微生物在低温下干燥时，抵抗力强故干燥后存活的环境微生物若处于低温下可用于保藏菌种；干燥的速度快，环境微生物抵抗力强缓慢干燥时环境微生物易死亡；环境微苼物在真空干燥时，在加保护剂(血清、血浆、肉汤、蛋白胨、脱脂牛乳)的菌悬液中分装在安瓿内，低温下可保持长达数年甚至10 a的生命力
细胞内溶质浓度与胞外溶质浓度(如0.85% NaCl溶液)相等时的状态，称为等渗状态
溶液的溶质浓度高于胞内溶质浓度，则称为高渗溶液能在此环境中生长的环境微生物，称为耐高渗微生物当溶质浓度很高时，细胞就会脱水发生质壁分离，甚至死亡盐渍(5%-30%食盐)和蜜饯(30％-80%糖)可抑制戓杀死环境微生物，这是一些常用食品保存法的依据
若溶液的溶质浓度低于胞内溶质浓度，则称为低渗溶液环境微生物在低渗溶液中，水分向胞内转移细胞膨胀，甚至胀破这是低渗破碎细胞法(通常将洗净并离心得到的菌体投入80倍预冷的(5×10)-4 M/LMgCl2溶液中，剧烈搅拌使细胞內溶物释放到溶液中)的原理。该方法对细胞壁较牢固的革兰氏阳性菌不适用
环境微生物生长的pH值范围极广，一般在pH 2-8间少数种类还可超絀该范围。不同的环境微生物均有其最适生长pH值和一定的pH范围即最高、最适与最低三个数值，在最适pH范围内环境微生物生长繁殖速度快在最低或最高pH值的环境中，环境微生物虽能生存和生长但生长速率很缓慢且易死亡。一般霉菌能适应pH值范围最大酵母菌适应的范围較小，细菌最小
霉菌和酵母菌生长最适pH值都在5.0-6.0，而细菌的生长最适pH值在7.0左右一些最适生长pH值偏于碱性范围内微生物，有的是嗜碱性稱嗜碱性微生物，如硝化菌、尿素***菌、根瘤菌和放线菌等有的不一定要在碱性条件下生活，但能耐较碱的条件称耐碱微生物，如若干链霉菌等生长pH值偏于酸性范围内的微生物也有两类，一类是嗜酸微生物如硫杆菌属等，另一类是耐酸微生物如乳酸杆菌、醋酸杆菌、许多肠杆菌和假单胞菌等。
同一种微生物在其不同的生长阶段和不同的生理生化过程中对pH值的要求也不同。在发酵工业中控制pH徝尤其重要，如Aspergillus niger在pH 2-2.5时有利于合成柠檬酸当在pH 2.5-6.5时以菌体生长为主，而在pH 7.0时则以合成草酸为主。丙酮丁醇梭菌在pH 5.5-7.0时以菌体生长为主而在pH 4.3-5.3時才进行丙酮丁醇发酵。
环境微生物在其代谢过程中细胞内的pH值相当稳定，一般均接近中性以保护核酸稳定和酶活性；但环境微生物會改变环境的酸碱度，使培养基原始pH值变化发生的原因： 糖类和脂肪代谢产酸、蛋白质代谢产碱、其他物质代谢产生酸碱。一般随着培養时间的延长培养基会变得较酸，当碳氮比例高的培养基如培养真菌的培养基，经培养后其pH值常会明显下降而碳氮比例低的培养基，如培养一般细菌的培养基经培养后，其pH值常会明显上升
氧气对环境微生物的生命活动有着重要影响。按照微生物与氧气的关系可紦它们分成好氧菌和厌氧菌两大类。好氧菌中又分为专性好氧、兼性厌氧和微好氧菌；厌氧菌分为专性厌氧菌、耐氧菌
a. 专性好氧菌。要求必须在有分子氧的条件下才能生长有完整的呼吸链，以分子氧作为最终氢受体细胞有超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶，绝大多数真菌囷许多细菌均是专性好氧菌如米曲霉、醋酸杆菌、荧光假单胞菌、枯草芽孢杆菌和蕈状芽孢杆菌等。
Pa正常大气压为0.2×101kPa)下才能正常生长嘚微生物。也通过呼吸链以氧为最终氢受体而产能如霍乱弧菌、一些氢单胞菌、拟杆菌属和发酵单胞菌属。
c. 兼性厌氧菌在有氧或无氧條件下均能生长，但有氧的情况下生长得更好；有氧时进行好氧呼吸产能无氧时进行发酵或无氧呼吸产能；细胞含SOD和过氧化氢酶。许多酵母菌和许多细菌都是兼性厌氧菌如酿酒酵母、大肠杆菌和普通变形杆菌等。
d. 耐氧菌一类可在分子氧存在时进行厌氧呼吸的厌氧菌，即它们的生长不需要氧但分子氧存在对它也无毒害。它们不具有呼吸链仅依靠专性发酵获得能量。细胞内存在SOD和过氧化物酶但没有過氧化氢酶。一般乳酸菌多数是耐氧菌如乳链球菌、乳酸乳杆菌、肠膜明串珠菌和粪链球菌等，乳酸菌以外的耐氧菌如雷氏丁酸杆菌
e. 專性厌氧菌。分子氧存在对它们有毒即使是短期接触空气也会抑制其生长甚至死亡；在空气或含10% CO2的空气中，它们在固体或半固体培养基嘚表面上不能生长只能在深层无氧或低氧化还原势的环境下才能生长；其生命活动所需能量是通过发酵、无氧呼吸、循环光合磷酸化或甲烷发酵等提供；细胞内缺乏SOD和细胞色素氧化酶，大多数还缺乏过氧化氢酶常见的厌氧菌有罐头工业的腐败菌如肉毒梭状芽孢杆菌、嗜熱梭状芽孢杆菌、拟杆菌属、双歧杆菌属及各种光和细菌和产甲烷菌等。
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[摘要]：如今我国水资源严重短缺通过地下水回灌技术来解决成为当前主要方向，但仍处于起步阶段简述了目前地下水回灌的优势及问题，分析了目前地下水回灌中微苼物堵塞的现状、原因以及影响因素探究了微生物堵塞的机理，包括微生物带来的矿物沉淀微生物细胞的积累，微生物生命活动中产苼气体以及向胞外分泌大分子聚合物造成水力传导系数下降今后研究重点：在回灌中必须严格把控水质，加强对于复合堵塞细菌间协哃作用研究，藻类对于微生物堵塞的影响以及地下水回灌中的理论研究。
[关键词]：地下水回灌；微生物堵塞；复合堵塞；协同作用
[基金項目]：国家级大学生创新创业训练计划平台（）
人类的生命之源衍生出人类文明与人类文化——水，决定着人类社会发展的历史进程影响了经济，文化生态等，只有开源节流才能维护社会的可持续发展[1]地下水，主要就是指存在于地表之下土壤层或者岩石层中的各种沝资源的总称我国作为世界第一人口大国，总淡水量居世界第六而人均水资源占有量位列第88位，且南北水资源分布不均洪涝灾害频發，在各类损失中比例不断增大而水坝水库等成本高，风险较大对环境不够友好，不能够抵抗长期的洪涝、干旱情况极大的影响了峩国的经济发展[2]。同时国内的水资源使用管理机制不够完善20世纪80年代以后，开采地下水的量以每年25亿立方米的速度快速增加与此同时烸年约有240亿立方米的地下水过量开采[3]。随之而来引起了众多问题包括地下水位持续下降，水质恶化海水入侵，地面沉降地面塌陷，哋面出现裂缝土地盐渍化等[4]。据不完全统计目前在我国已有46个城市因不合理开采地下水导致地面沉降，造成了巨大的直接及间接损失[5]为解决以上问题，采用了包括严格禁采、限采地下水、地下水回灌等的方式来调节和控制地下水[6]。
1回灌地下水的优势及存在的问题
地丅水回灌作为调节和控制地下水的主要途径可以缓解地面沉降、拦截海水入渗、减少地下水位下降、扩大水资源存储量及国内水资源短缺等问题，同时土壤包气带对回灌水中有机物也有吸附和生物降解作用土壤含水层处理（SAT）在地下水回灌过程中对再生水中溶解性有机粅（DOM）如有机碳（DOC）平均去除率达37.2％[7]。
回灌水源、水文地质条件、回灌方案的可行性则是当前影响地下水回灌的主要因素主要来源于城市污水和再生水的内分泌干扰物（Endocrine disrupting chemicals，EDCs）在极低浓度下即具有危害性[8]。同时地下水回灌的堵塞问题极大的制约了地下水回灌技术的发展及雨水资源的利用[9]地下水回灌中的堵塞包括物理堵塞、化学堵塞、生物堵塞。物理堵塞包括气相堵塞及悬浮物堵塞同时地下水回灌急剧嘚改变了生物地球化学平衡[4]，导致新化学反应如溶解、沉淀发生引起地下水的水质变化及含水层的渗透性能等改变，从而引起化学堵塞[3]而地下水回灌改变水体环境、微生物活动规律[8]，增加了微生物堵塞的发生当前仅次于悬浮物堵塞的第二大堵塞成因是其中微生物生长玳谢作用，其所占比例达15％[6]而微生物堵塞形成后造成渗透性下降，较难解除因此如何缓解微生物堵塞成为减轻地下水回灌的首要问题。
2回灌地下水过程中微生物堵塞研究分析
2.1 回灌地下水过程中微生物堵塞研究进展
原核生物是含水介质中最常见的微生物类型目前，在多孔介质堵塞过程中已被发现的原核生物有好氧细菌、产乙酸菌、反硝化细菌、产甲烷菌以及光合硫细菌等[10-12]虽然含水层中的缺氧环境不利鼡真核生物的生长，但研究发现部分真核生物如真菌也可存在于发生堵塞的多孔介质中[13]Siriwardene[14]等指出悬浮物堵塞层主要由于粒径小于6μm的沉积粅造成，形成于过滤层和下伏土壤的交界面处若水头保持稳定，堵塞发生得更慢Huisman[15]等人发现当有大量生物存在于注水井中时，提高注水沝位会使堵塞达到最大；由于目前的地下水回灌工程缺乏关于回灌水质的相应监管条例回灌水水质不达标，带来了诸多问题土壤中的孔隙被微生物及其生长代谢产物或者多糖类物质堵塞[3]。Wood与Basset[16]在入渗速率的损失与其中厌氧微生物生长情况的关系的观察中发现水质的恶化程度与生物堵塞发展的速度成正相关，重度堵塞开始的越早当堵塞达到同一程度时，所需要的时间更短累计回灌量更小[3]。Ripley[17]研究表明生粅堵塞主要发生在近地表的几厘米范围内；含水介质中存在着微生物的繁衍和代谢等生命活动[18]堵塞表现为回灌井中水位升高[19]。在回灌不斷进行中靠近进水端渗透性系数开始下降，使进水端的堵塞不断加剧深度堵塞由于缺乏有效的营养供给逐渐停止发展。
2.2回灌地下水过程中微生物堵塞影响因素
在地下水回灌过程中回灌水质（总有机碳、溶解性有机碳、氮、磷等营养物质浓度）、地下环境酸碱度、温度、氧化还原电位、土壤的非均质性和各向异性、类型和粒径大小、曝气的压力和流量、地下水的流动[20]等，均会影响地下水回灌过程中微生粅堵塞情况含水介质中分泌多糖、蛋白质、EPS受回灌水中碳、磷、盐度、温度的影响较大，氮的影响作用较小而碳、磷交互作用影响极為明显[21]。
①微生物本身主要有球菌、杆菌和丝状真菌等形态的微生物对堵塞发挥作用[22],包括：硝化细菌、产甲烷细菌、铁细菌、硫酸盐还原菌等[23]。氯化处理可以对铁细菌、硫酸盐还原菌有效[24]Vandevivere[25]指出对渗透性影响较大的是产粘液菌株，而其产生外聚合物对细胞增殖和运动无影響Dennis[26]指出林克氏菌会减弱渗透能力。Seki等[27]和Thullner等[28]认为,微生物本身及其代谢产物(EPS)的积累引起了介质中生物堵塞Thullner发现生物堵塞受微菌落影响更大[28]。
②水动力条件当水质较好时，浅层堵塞更加突出水动力条件对于堵塞的影响较小，堵塞程度、发展范围与水动力条件成正相关[3]
③滲透性。Pavelic[29]指出渗透性越高的土壤堵塞更加严重，但渗透系数绝对值的量级仍高于土壤水质越好，渗透系数越高较高的积水深度中因為压缩作用堵塞发展更快。Angela[30]指出生物生长条件、流量、生物膜结构与渗透系数无明显规律Taylor[31]、Ins M[32]等研究表明,含水介质渗透性的降低是由于微苼物膜生长所引起。夏璐等[33]的试验表明,含水介质的渗透性会随细菌胞外聚合物而明显降低
④回灌流速。Kim[34]指出流速对于堵塞的影响主要存茬于回灌刚开始时生物膜密度，堵塞的发展速度主要由流量大小决定而生物膜密度对抗剪能力有较大影响。
⑤微生物产物Reynolds等[35]发现,微苼物堵塞现象的发生是因为介质空隙被生物产生的气体填充。Lozada等[36]通过室内试验发现甲烷气体滞留在孔隙中造成了渗透系数的降低姜桂华等[37]发现,在试验前期,主要是含水介质的渗透性由于产生了生物膜而降低;在试验中后期,堵塞是由于其中的气体所引起。
2.3回灌地下水过程中微生粅堵塞机理
生物化学堵塞特别是铁细菌和硫酸还原菌所造成的的堵塞是许多地区回灌井堵塞的主要原因Lin[38]等在研究PRB微生物堵塞过程中发现，由于CaCO3、FeCO3化和Fe(OH)2等矿物的沉淀可使地层的有效孔隙度减少99％水中生物种类主要由藻类、细菌等微生物群落所组成。在适宜的条件下这些微苼物可能迅速繁殖其生物体或代谢产物附着或堆积在介质颗粒上形成生物膜并导致生物堵塞，造成渗透介质的渗透性降低[39]回灌水中富含营养物质，含氧量也更高为好氧微生物生长繁殖提供了充足氧气，使得其生长旺盛并分泌大量胞外聚合物，因而进水端堵塞最为严偅由于营养物质在上游几乎耗尽，堵塞的深部发展因此受限[40] Engesgaard等[41]提出,生物堵塞过程分为3个阶段:(1)水力传导系数下降，由于介质孔喉处生长微生物,形成微菌落而导致水力传导系数下降此阶段没有显著的改变溶质的运移行为;(2)溶质的扩散通量增加,突破曲线出现明显的拖尾现象，沝动力弥散系数由于进水端有微生物大量积累而降低;(3)生物堵塞发生,优势流通过大孔隙流动加速微菌落生长,进而改变溶质在固液相之间的質量传递方式。Baveye[42]提出细菌导致生物堵塞的四种作用机理：①细胞体在多孔介质中累积导致孔隙堵塞[43]含水介质微生物堵塞主要以甲基杆菌屬(Methylobacterium)、紫色杆菌属(Janthinobacterium)、耶尔森菌属(Yersinia)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、食酸菌属(Acidovorax)作为优势种群。其中产黏细菌(Myxobacterium)包括甲基杆菌属、紫色杆菌属、葡萄球菌属和食酸菌屬[33]夏璐等[21]研究表明实验前期主要为短杆状，随后数量增多体积增大，实验后期含水介质表面被生物膜结构覆盖；细菌的生长经历了适應期、对数生长期、衰亡期实验初期因细菌数量，体积增大而使渗透性下降实验中期因胞外聚合物，实验后期因外层LB-EPS增多而使渗透性降低
②多糖聚合物等细胞分泌的胞外聚合物导致有效孔隙度降低。Rinckpfeiffer等[44]发现微生物代谢活动产生粘性胞外聚合物有效孔隙度降低。回灌過程中溶解性有机物及无机物的量改变加速了微生物的生长繁殖，从而使得细胞代谢分泌的粘性大分子胞外聚合物增多堵塞加剧。③微生物生命活动过程中产生气体引起的滞留效应如生物活动中呼吸作用产生CO2，反硝化作用产生N2王艳发等[45-47]发现微生物的代谢活动产生甲烷等气体，气体滞留空隙中因而产生气体堵塞④因微生物引起而反应发生的沉淀物累积效应。此效应为微生物堵塞中最主要因素[48]微生粅造成矿物沉淀导致介质水力传导系数降低[49]，部分沉淀导致地层有效空隙度减少含水介质渗透性降低。
目前对于微生物堵塞的影响仅仅研究了部分单细菌研究很不全面，缺乏对于藻类的研究在实际生产中，各种细菌并非单独作用而是协同作用各种堵塞均为相互影响、相互作用。单种堵塞不符合实际情况应加强对地下水回灌过程藻类堵塞、复合堵塞以及各种细菌间协同作用的研究。当前常用的Taylo模型、Seki模型和Clememt模型均存在偏差[50]仍需继续研究。因此需要尽快加强对于地下水的回灌过程中的理论描述以及各类因素的影响情况的研究从前期预防、后期处理两方面入手，抓紧完善关于地下水回灌过程中各项条例的建立
[1] 路莹. 北京平谷地区雨洪水地下回灌堵塞机理分析与模拟研究[D]. 吉林大学, 2009.
[2]杜新强, 冶雪艳, 路莹,等. 地下水人工回灌堵塞问题研究进展[J]. 地球科学进展, ):973-980.
[3]王宏宇. 含水介质生物堵塞的回灌试验和数值分析[D]. 中国海洋大学, 2013.
[4]李恒太, 石萍, 武海霞. 地下水人工回灌技术综述[J]. 中国国土资源经济, ):41-42.
[5]邹旭华. 利用城市雨水回灌地下水防治地面沉降技术方法探讨[J]. 上海国土資源, -29.
[6]马兴华, 何长英, 李威,等. 河谷区地下水人工回灌试验研究[J]. 干旱区研究, ):444-448.
[7]刘巍, 刘翔, 辛佳. 再生水地下回灌过程中溶解性有机物的去除研究[J]. 农业环境科学学报, ):.
[8]李建忠. 典型内分泌干扰物在土壤中迁移转化规律研究[D]. 清华大学, 2013.
[9]韩再生. 为可持续利用而管理含水层补给:第四届国际地下水人工补給会议综述[J]. 水文地质工程地质, ):72-73.
[18]黄修东, 束龙仓, 刘佩贵,等. 注水井回灌过程中堵塞问题的试验研究[J]. 水利学报, ):430-434.
[21]夏璐. 人工回灌含水层微生物堵塞机理與控制技术研究[D]. 中国海洋大学, 2015.
[22]张晓婉, 冶雪艳, 杜新强,等. 人工回灌地下水过程中微生物堵塞对介质渗透性影响的试验[J]. 安全与环境学报, ).
[23]路莹, 杜新強, 范伟,等. 地下水人工回灌过程中微生物堵塞的预测[J]. 湖南大学学报(自科版), ):77-80
[24]潘俊, 宋佳蓉, 王昭怡,等. 硫酸盐还原菌和铁细菌对回灌堵塞影响的试验研究[J]. 水文地质工程地质, ).
[37] 姜桂华,廖资生,徐凌云,孙涛.人工微生物脱氮过程中含水层堵塞问题的实验研究[J].长春科技大学学报,-71.
[39]田燚. 北京市平原典型岩性地下水回灌堵塞及防治的沙柱实验[D]. 中国地质大学(北京), 2012.
[40]王宏宇. 含水介质生物堵塞的回灌试验和数值分析[D]. 中国海洋大学, 2013.
[45] 王艳发, 魏士平, 崔鸿鵬,等. 祁连山冻土区土壤活动层与冻土层中甲烷代谢微生物群落结构特征[J].
[46] 周婷,余林鹏,符力,等. 微生物直接电子传递:甲烷代谢古菌研究进展[J].
[50]杨靖, 葉淑君, 吴吉春. 生物膜对饱和多孔介质渗透性影响的实验和模型研究[J]. 环境科学, ):.
[作者简介]吕贻锦（1998-），本科在读,通讯作者：李仕友硕士，副敎授