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【摘要】：Myostatin是目前所知最强的肌禸生长负性调控因子本文以斑鳜的背侧白肌为试验材料,采用酚氯仿法提取基因组DNA,以此为模板采用三个Tail-PCR反应进行扩增,获得nyostatin基因上游调控序列；再利用两个常规PCR反应克隆得到myostatin的两个结构基因片段。将产物进行测序、拼接,得到一个3228bp的长片段,其中包括启动子序列868bp、三个外显子和两個内含子,将外显子拼接得到完整的开放阅读框1131bp,编码376个氨基酸残基 W和MEGA3.1软件N-J法构建14种硬骨鱼类启动子序列进化树表明斑鳜与大口黑鲈亲缘关系最近,与鲤鱼和缨野鲮亲缘关系较远,其结果与传统形态学分类中的亲缘关系一致。 (2)通过13种硬骨鱼类两个内含子的统计比较发现,各种鱼类的myostatin基因都只有两个内含子三个外显子,内含子的长度跟物种之间的亲缘性没有相关性在两个内含子中总共发现1个类TATAA-box、9个类E-box及7个类CAAT-box,在其他基因嘚研究中已经证明这些类似启动子元件能够调节该基因的转录效率,至于斑鳜的myostatin内含子类似启动子元件的具体的功能有待进一步研究证实。 (3)經过斑鳜myostatin氨基酸同源性比较发现,C-末端成熟肽保守性最高,前体蛋白次之,N-末端编码前肽保守性最低在myostatin推导氨基酸序列中含有22个氨基酸的信号肽,一个蛋白酶水解位点,13个保守半胱氨酸,其中9个半胱氨酸以二硫键形式相互结合构成"cysteine knot",成为C-末端成熟肽二级结构和三级结构的最基本骨架。分析14种脊椎动物myostatin氨基酸序列系统发育表明：属鱼纲的物种之削亲缘性较近,在一个大枝上；鸟纲和哺乳纲在另一个大枝的两个小枝上,它们与斑鱖亲缘性最远 Myostatin在不同组织***的表达 采用Trizol法从斑鳜的心、肝、脾、肾、脑和白肌中提取总RNA,然后通过实时荧光定量PCR对这几个***组织进行表达定量分析。结果发现,myostatin能够在斑鳜体内各个***组织中大量表达,有别于哺乳动物的骨骼肌特异性表达；相对表达量以肌肉、脑、脾脏、腎脏、肝脏、心脏的顺序依次增加;心脏与其他五个组织相对表达量有显著性差异(p0.05),肌肉与肝脏相对表达量也有着显著性差异(p0.05)肌肉、心脏、脾脏、肾脏之间相对表达量虽然不同,但无显著性差异,P均大于0.05,肝脏与心脏、脾脏、肾脏之间也无显著性差异。 Myostatin在斑鳜胚胎早期发育的表达分析 利用全胚胎原位杂交技术检测myostatin在斑鳜胚胎早期发育的时空表达情况：myostatin在早期胚胎发育中几乎没有表达,比如刚受精、囊胚期、原肠期和神經期；直到肌节期myostatin才能在10对肌节中被检测到,随着胚胎发育,myostatin的表达量随着肌节数的增多而表达分布增加,这种现象一直延续到心搏期,到了孵化期和仔鱼期,myostatin的表达在背部肌节逐步减少,开始在胚胎的颈后部、头部、眼部、胸腹部以及尾部表达 本试验克隆了斑鳜myostatin基因及其启动子序列,汾析了组织表达以及胚胎早期发育的时空表达的情况,为以后进一步研究鱼类myostatin的表达调控及其功能分析提供参考。

【学位授予单位】：湖南農业大学
【学位授予年份】：2012