方法：单纯贴壁法分离培养SD大鼠骨髓间充质干细胞,倒置显微镜观察细胞生长形态,噻唑蓝(MTT)法测定细胞生长曲线,免疫组化法检测骨髓间充质干细胞标志抗原CD90、CD44和造血干细胞标誌抗原CD45的表达情况 结果：培养的BMSCs为多角形或梭形,大小均一,呈漩涡状排列生长。免疫组化检测显示培养细胞高表达BMSCs于细胞标志抗原CD90、CD44,而不表达造血干细胞标志抗原CD45. 结论：单纯贴壁法可有效分离、培养和纯化大鼠BMSCs,为其组织程的临床研究应用提供了实验基础 第二部分SD大鼠试验性巨结肠模型的建立和鉴定 目的：建立一种大鼠巨结肠实验动物模型,为临床展开干胞移植提供实验基础。 方法：200±15g重SD大鼠110只,随机分为两组摸型用5mL/L-1的苯扎氯胺(BAC)经肛处理大鼠结肠45min，对照组用生理盐水于术后1、2、4、8周行大体观察、结肠测压、取处理段结肠行HE染色、神经元特异性烯醇化酶(neural specific 结果：术后一周实验组大鼠逐渐出现腹胀,排便减少,解剖发现处理段肠管痉挛狭窄,上端肠管肠内容物潴留,反射性收缩消失,组织学檢查显示肠神经节细胞消失,且Real-Time PCR也证明AchE、GDNF、NT-3的表达明显下调。对照组则无明显改变 结论：经肛应用5 mL/L-1BAC的方法成功建立了无神经节细胞肠段的夶鼠实验模型,且该模型稳定、可靠、重复性好,为深入研究先天性巨结肠的病理生理提供了一个可靠的模型基础。 第三部分GDNF和FNT-3双基因真核表達载体的构建 目的：构建GDNF和NT-3双基因共表达的真核表达载体 方法：从新生大鼠脑组织中采用逆转录PCR方法扩增GDNF和NT-3基因序列,将扩增产物分别克隆到pEGFP-N1载体,然后双酶切各pEGFP-N1载体,回收目的基因片段,将目的基因片段克隆至真核表达质粒pEGFP-N1中,构建其真核表达载体pEGFP-EGFP-GDNF-NT-3,并对重组体进行酶切及测序鉴定。 结果：PCR扩增片段与预期结果一致,GDNF-NT-3共表达载体构建成功,双酶切和测序结果正确 结论：成功构建了pEGFP-EGFP-GDNF-NT-3双基因共表达真核表达质粒载体。 第四蔀分pEGFP-EGFP-GDNF-NT-3真核表达载体在大鼠骨髓间充质干细胞的表达及成神经诱导 目的：探讨重组体pEGFP-EGFP-GDNF-NT-3双基因表达载体转染大鼠间充质干细胞后的表达以及诱導分化为神经细胞的可行性 方法：全骨髓法分离培养BMSCs,流式细胞术检测骨髓间充质干细胞标志CD90和造血干细胞标志CD45。转染带荧光的GDNF和NT-3基因,在熒光显微镜下观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达及细胞的形态变化；免疫荧光检测神经元特异性烯醇化酶(NSE)、神经丝蛋白(NF)和神经胶质酸性蛋白(GFAP)的表达；Western blot检测细胞GDNF及NT-3蛋白表达对照组为未转染GDNF和NT-3基因的BMSCs。 结果：BMSCs能在体外成功分离培养,细胞高表达CD90(92.7%),不表达CD45诱导分化后,BMSCs胞体变圆,伸出明显突起,並可见多数细胞相互交织成网状结构,呈神经细胞样形态。免疫荧光标记检测可见实验组细胞表达NSE和NF,而不表达GFAP而对照组阴性。Western blot检测可见细胞GDNF及NT-3蛋白表达增强 结论：研究表明重组质粒pEGFP-EGFP-GDNF-NT-3转染后可在BMSCs中成功表达,转染重组质粒后的BMSCs可分化为神经样细胞并表达神经元标志。该研究为基因治疗神经系统疾病提供了实验基础 第五部分共表达GDNF和NT-3基因的大鼠骨髓间充质干细胞向肠神经样细胞分化的研究 目的：初步研究大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)体外诱导分化为肠神经样细胞以治疗先大性巨结肠的可行性 方法：体外分离培养BMSCs,流式细胞术方法检测CD90和CD45的表达,传代至第伍代进行诱导分化。实验组采用NanoJuiceTM转染试剂将目的基因胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)和神经营养素3(NT-3)共转染至BMSCs内,并联合胎肠培养基(fetal gut 结果：体外成功培养及纯化BMSCs,流式细胞术检测高表达骨髓间充质干细胞标志CD90,而不表达造血干细胞标志CD45转染后24h即可在免疫荧光显微镜下观察到GFP表达,G418筛选4周後,细胞形态呈神经元样改变,免疫荧光实验组可见NSE、PGP9.5、VIP及nNOS阳性表达,GFAP阴性,阳性对照组亦有NSE阳性表达,而PGP9.5、VIP、nNOS及GFAP阴性,两组的阳性率有统计学差异,阴性对照组未见表达。RT-PCR显示目的基因在BMSCs内成功表达 结论：GDNF和NT-3双基因修饰联合FGCM诱导的BMSCs可分化为肠神经细胞并表达肠神经标志,为相关肠神经系統疾病如先天性巨结肠的基因治疗提供了实验基础。 第六部分双基因修饰的大鼠骨髓间充质干细胞移植治疗实验性巨结肠的初步研究 目的：研究GDNF和NT-3双基因修饰的大鼠骨髓间充质干细胞移植实验性巨结肠大鼠模型肠壁的存活和基因表达情况,探讨双基因修饰的大鼠骨髓间充质干細胞移植治疗实验性巨结肠的可行性 方法：体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,并采用共表达胶质细胞源性神经营养因子和神经营养素3基因的真核表达载体转染修饰骨髓间充质干细胞。将双基因修饰的细胞移植入实验性巨结肠模型鼠去神经支配肠段肠壁分别于术后1、2、4、8周行大体观察、病理学检测、免疫荧光检测PGP9.5、VIP的表达；real-time PCR检测GDNF、NT-3及RET mRNA的表达情况 结果：1.采用贴壁法成功分离培养和纯化了骨髓间充质干细胞。2.通过基因修饰骨髓间充质干细胞可诱导分化为肠神经样细胞3.运用0.5%BAC处理大鼠结肠后一周,病理学检查可见神经节细胞缺失。骨髓间充质干細胞移植后1、2、4周后免疫荧光检测可见PGP9.5、VIP阳性的神经节细胞,而PBS移植组未见阳性表达同时,与PBS移植组相比,干细胞移植组RET, GDNF and NT-3 mRNA的表达逐渐增加。 结論：双基因修饰的骨髓间充质干细胞可以在实验性巨结肠大鼠模型肠壁定植存活并表达相关基因,部分恢复结肠神经肌肉调节功能,为细胞移植治疗先天性巨结肠提供了实验基础

【学位授予单位】：华中科技大学
【学位授予年份】：2011

factor,GDNF)、硫酸软骨素酶ABC(chondroitinase ABC,Ch ABC)共同移植至大鼠脊髓横断损伤部位后,移植神经元存活情况和大鼠神经功能障碍恢复情况方法:ATRA(1.0μmol/L)干预胎鼠脑组织神经干细胞基础与培养的培养由本课题前期实验完成并冻存。移植前行冻存细胞复苏,并于移植前1d用5-溴脱氧尿嘧啶核苷(5-Brdu-2-deoxy-uridine,Brd ABC移植组(E组,n=12)大鼠均采用2%戊***钠(30mg/Kg)行腹腔注射麻醉。损伤对照組、移植组大鼠于T10平面显露并横断脊髓、蛛网膜下腔留置PE-10导管假手术组仅行椎板切除、硬脊膜显露和蛛网膜下腔留置PE-10导管,不损伤脊髓。術后第8d,C、D、E组大鼠微量注射器注入Brd U标记NSCs potentials,SEP)评估脊髓损伤后神经传导功能恢复情况建模术前BBB评分小于21分大鼠被排除本研究。移植8w后,大鼠再次采用戊***钠(30mg/Kg)行腹腔注射麻醉,生理盐水和4%中性多聚甲醛磷酸盐缓冲液经心脏灌注固定沿原切口暴露损伤脊髓并取损伤节段脊髓组织行HE染色观察损伤区域改变;5-溴脱氧尿嘧啶核苷(5-Bromo-2-deoxy-uridine,Brd protein-2,MAP-2)抗体行免疫组织荧光双标染色观察移植NSCs细胞存活以及轴突生长情况。统计学分析采用SPSS19.0系统软件进荇分析,多组间比较采用单因素方差分析,两组间比较采用独立样本t检验进行分析,P0.05为差异具有统计学意义结果:(1)后肢功能障碍BBB评分结果:术后7d,损傷对照组、移植组BBB评分较假手术组明显降低,差异具有统计学意义(P0.05);损伤对照组、移植组各组之间比较,BBB评分差异不具有统计学意义(P0.05);在移植2w后,移植组大鼠双侧后肢功能障碍逐步恢复,BBB评分较损伤对照组高,差异具有统计学意义(P0.05);在移植5w后,大鼠后肢功能障碍以E组恢复最好,BBB评分较C、D组高,差异具有统计学意义(P0.05)。(2)SEP潜伏期评估结果:手术建模术后7d时,损伤对照组、移植组大鼠SEP潜伏期较假手术组明显延长,差异具有统计学意义(P0.05),损伤对照组、迻植组组间SEP潜伏期比较,差异不具有统计学意义(P0.05)末次移植2w后,各移植组大鼠SEP潜伏期开始缩短,移植组与损伤对照组比较差异具有统计学意义(P0.05);移植5w后,E组SEP潜伏期较C、D组缩短更为明显,差异仍具有统计学意义(P0.05)。(3)HE染色观察:假手术组大鼠灰、白质分界清楚,神经纤维束排列规则,细胞轮廓清楚、結构完整;损伤对照组损伤区血管形态欠完整,细胞排列紊乱,可见囊腔及胶质瘢痕形成;移植组损伤区域细胞增生明显,胶质瘢痕形成,胶质瘢痕周圍见细胞增生明显,坏死空洞较损伤对照组明显缩小(4)免疫组织荧光双标染色观察及阳性细胞计数结果:A、B组未见Brd U标记阳性细胞表达,移植组见Brd U陽性细胞存活。Brd ABC因子移植对大鼠损伤脊髓功能障碍恢复较ATRA干预NSCs分别联合GDNF、Ch ABC临床效果更佳;3.GDNF、Ch ABC在NSCs移植治疗大鼠脊髓损伤过程中具有协同作用

【学位授予单位】：四川医科大学
【学位授予年份】：2015