利用逆转录酶和mRNA模版合成cDNA的主要步骤是什么
1、以mRNA为模板,以四种脱氧核苷酸作原料,在逆转录酶作用下,合成DNA单链2、以DNA单链为模板,以四种脱氧核苷酸作原料,继续合成DNA另一条链,两条DNA链形成cDNA
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　　RT-PCR（25μL）　　RNA：
5μL　　dNTP：
10mM 1.25μL；2.5mM 5μL　　oligod（T）：1μL
↓65℃，5min　　
-20℃，2min
↓　　M-M...
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第三方登录：导读：RNA的提取和cDNA合成原理和实验方法，从真核生物的组织或细胞中提取mRNA,通过酶促反应逆转录合成cDNA的第一链和第，总之cDNA的合成和克隆已成为当今真核，cDNA合成效率的方法,并大大改进了载体系统，目前cDNA合成试剂已商品化，成及克隆的基本步骤包括用反转录酶合成cDNA第一链,聚合酶合成cDNA第二链,加，模板mRNA的质量直接影响到cDNA合成的效率，受RNA酶的攻击反应而降解
RNA的提取和cDNA合成原理和实验方法
第一节. 概述
从真核生物的组织或细胞中提取mRNA,通过酶促反应逆转录合成cDNA的第一链和第
二链,将双链cDNA和载体连接,然后转化扩增, 即可获得cDNA文库,构建的cDNA文库可用
于真核生物基因的结构、表达和调控的分析;比较cDNA和相应基因组DNA序列差异可确
定内含子存在和了解转录后加工等一系列问题。总之cDNA的合成和克隆已成为当今真核
分子生物学的基本手段。自70年代中叶首例cDNA克隆问世以来,已发展了许多种提高
cDNA合成效率的方法,并大大改进了载体系统，目前cDNA合成试剂已商品化。cDNA合
成及克隆的基本步骤包括用反转录酶合成cDNA第一链,聚合酶合成cDNA第二链,加入合成
接头以及将双链DNA克隆到于适当载体(噬菌体或质粒)。
一.RNA制备
模板mRNA的质量直接影响到cDNA合成的效率。由于mRNA分子的结构特点,容易
受RNA酶的攻击反应而降解,加上RNA酶极为稳定且广泛存在,因而在提取过程中要严格防
止RNA酶的污染,并设法抑制其活性,这是本实验成败的关键。所有的组织中均存在RNA酶,
人的皮肤、手指、试剂、容器等均可能被污染，因此全部实验过程中均需戴手套操作并经常
更换（使用一次性手套）。所用的玻璃器皿需置于干燥烘箱中200℃烘烤2小时以上。凡是
不能用高温烘烤的材料如塑料容器等皆可用0.1%的焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶液处理,再用
蒸馏水冲净。DEPC是RNA酶的化学修饰剂,它和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环反应
而抑制酶活性。DEPC与氨水溶液混合会产生致癌物,因而使用时需小心。试验所用试剂也
可用DEPC处理,加入DEPC至0.1%浓度,然后剧烈振荡10分钟,再煮沸15分钟或高压灭菌
以消除残存的DEPC,否则DEPC也能和腺嘌呤作用而破坏mRNA活性。但DEPC能与胺和
巯基反应,因而含Tris和DTT的试剂不能用DEPC处理。Tris溶液可用DEPC处理的水配制
然后高压灭菌。配制的溶液如不能高压灭菌,可用DEPC处理水配制,并尽可能用未曾开封的
试剂。除DEPC外,也可用异硫氰酸胍、钒氧核苷酸复合物、RNA酶抑制蛋白等。此外,为了
避免mRNA或cDNA吸附在玻璃或塑料器皿管壁上,所有器皿一律需经硅烷化处理。
细胞内总RNA制备方法很多,如异硫氰酸胍热苯酚法等。许多公司有现成的总RNA提
取试剂盒,可快速有效地提取到高质量的总RNA。分离的总RNA可利用mRNA 3'末端含有
多聚(A)+ 的特点,当RNA流经oligo (dT)纤维素柱时,在高盐缓冲液作用下,mRNA被特异的
吸附在oligo(dT)纤维素上,然后逐渐降低盐浓度洗脱,在低盐溶液或蒸馏水中,mRNA被洗下。
经过两次oligo(dT)纤维素柱,可得到较纯的mRNA。纯化的mRNA在70%乙醇中-70℃可保
存一年以上。
二.cDNA第一链的合成
所有合成cDNA第一链的方法都要用依赖于RNA的DNA聚合酶(反转录酶)来催化反
应。目前商品化反转录酶有从禽类成髓细胞瘤病毒纯化到的禽类成髓细胞病毒(AMV)逆转录
酶和从表达克隆化的Moloney鼠白血病病毒反转录酶基因的大肠杆菌中分离到的鼠白血病
病毒(MLV)反转录酶。AMV反转录酶包括两个具有若干种酶活性的多肽亚基,这些活性包括
依赖于RNA的DNA合成,依赖于DNA的 DNA合成以及对DNA:RNA杂交体的RNA部分
进行内切降解(RNA酶H活性)。MLV反转录酶只有单个多肽亚基,兼备依赖于RNA和依赖
于DNA的DNA合成活性,但降解RNADNA杂交体中的RNA的能力较弱,且对热的稳定性
较AMV反转录酶差。MLV反转录酶能合成较长的cDNA(如大于2-3kb)。AMV反转录酶和
MLV反转录酶利用RNA模板合成cDNA时的最适pH值,最适盐浓度和最适温室各不相同,
所以合成第一链时相应调整条件是非常重要。
AMV反转录酶和MLV反转录酶都必须有引物来起始DNA的合成。cDNA合成最常用
的引物是与真核细胞mRNA分子3'端poly(A)结合的12-18核苷酸长的oligo(dT)。
三.cDNA第二链的合成
cDNA第二链的合成方法有以下几种:
1. 自身引导法 合成的单链cDNA 3'端能够形成一短的发夹结构,这就为第二链的合成提供
了现成的引物,当第一链合成反应产物的DNA:RNA杂交链变性后利用大肠杆菌DNA聚合酶
Ⅰ Klenow片段或反转录酶合成cDNA第二链,最后用对单链特异性的S1核酸酶消化该环,
即可进一步克隆。但自身引导合成法较难控制反应，而且用S1核酸酶切割发夹结构时无一
例外地将导致对应于mRNA 5'端序列出现缺失和重排,因而该方法目前很少使用。
2. 置换合成法 该方法利用第一链在反转录酶作用下产生的cDNA:mRNA杂交链不用碱变
性,而是在dNTP存在下,利用RNA酶H在杂交链的mRNA链上造成切口和缺口。从而产生
一系列RNA引物,使之成为合成第二链的引物,在大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的作用下合成第二
链。该反应有3个主要优点: (1) 非常有效; (2) 直接利用第一链反应产物,无须进一步处理和
纯化;(3) 不必使用S1核酸酶来切割双链cDNA中的单链发夹环。目前合成cDNA常采用该
四.cDNA的分子克隆
已经制备好的双链cDNA和一般DNA一样,可以插入到质粒或噬菌体中,为此,首先必需
连接上接头(Linker),接头可以是限制性内切酶识别位点片段,也可以利用末端转移酶在载体
和双链cDNA的末端接上一段寡聚dG和dC或dT和dA尾巴,退火后形成重组质粒,并转化
到宿主菌中进行扩增。合成的cDNA也可以经PCR扩增后再克隆入适当载体。
第二节. 动植物组织mRNA的提取
水稻叶片或小鼠肝组织。
研钵，冷冻台式高速离心机，低温冰箱，冷冻真空干燥器，紫外检测仪，电泳仪，电泳
1、无RNA酶灭菌水：用将高温烘烤的玻璃瓶（180℃ 2小时）装蒸馏水，然后加入0.01%
的DEPC（体积/体积），处理过夜后高压灭菌。
2、75%乙醇：用DEPC处理水配制75%乙醇，（用高温灭菌器皿配制），然后装入高温
烘烤的玻璃瓶中，存放于低温冰箱。
3、1×层析柱加样缓冲液；20mmol/L Tris?Cl(pH7.6)，0.5mol/L NaCl，1mmol/L
EDTA(pH8.0)，0.1% SDS。
4、洗脱缓冲液：10mmol/L Tris?Cl (pH7.6)，1mmol/L EDTA (pH8.0)，0.05% SDS。
四、操作步骤
（一）动植物总RNA提取-Trizol法
Trizol法适用于人类、动物、植物、微生物的组织或培养细菌，样品量从几十毫克至几
克。用Trizol法提取的总RNA绝无蛋白和DNA污染。RNA可直接用于Northern斑点分析，
斑点杂交， Poly(A)+分离，体外翻译，RNase封阻分析和分子克隆。
1、将组织在液N中磨成粉末后，再以50-100mg组织加入1ml Trizol液研磨，注意样品
总体积不能超过所用Trizol体积的10%。
2、研磨液室温放置5分钟，然后以每1mlTrizol液加入0.2ml的比例加入氯仿，盖紧离
心管，用手剧烈摇荡离心管15秒。
3、取上层水相于一新的离心管，按每mlTrizol液加0.5ml异丙醇的比例加入异丙醇，
室温放置10分钟，12000g离心10分钟。
4、弃去上清液，按每ml Trizol液加入至少1ml的比例加入75%乙醇，涡旋混匀，4℃
下7500g离心5分钟。
5、小心弃去上清液，然后室温或真空干燥5-10分钟，注意不要干燥过分，否则会降低
RNA的溶解度。然后将RNA溶于水中，必要时可55℃-60℃水溶 10分钟。RNA可进行
mRNA分离，或贮存于70%乙醇并保存于-70℃。
[注意] 1、整个操作要带口罩及一次性手套，并尽可能在低温下操作。
2、加氯仿前的匀浆液可在-70℃保存一个月以上，RNA沉淀在70%乙醇中可在4℃保
存一周，-20℃保存一年。
（二）mRNA提取
由于mRNA末端含有多poly(A)+，当总RNA流径oligo(dT)纤维素时，在高盐缓冲液
作用下，mRNA被特异的吸附在oligo(dT)纤维素柱上，在低盐浓度或蒸馏水中，mRNA可
被洗下，经过两次oligo(dT) 纤维素柱，可得到较纯的mRNA。
1、用0.1mol/L NaOH悬浮0.5-1.0g oligo(dT)纤维素。
2、将悬浮液装入灭菌的一次性层析柱中或装入填有经DEPC处理并经高压灭菌的玻璃
棉的巴斯德吸管中，柱床体积为0.5-1.0ml，用3倍柱床体积的灭菌水冲洗柱床。
3、用1x柱层析加样缓冲液冲洗柱床，直到流出液的pH值小于8.0。
4、将（一）中提取的RNA液于65℃温育5分钟后迅速冷却至室温，加入等体积2x柱
层析缓冲液，上样，立即用灭菌试管收集洗出液，当所有RNA溶液进入柱床后，加入1倍
柱床体积的1x层析柱加样溶液。
5、测定每一管的OD260，当洗出液中OD为0时，加入2-3倍柱床体积的灭菌洗脱缓
冲液，以1/3至1/2柱床体积分管收集洗脱液。
6、测定OD260，合并含有RNA的洗脱组分。
7、加入1/10体积的3M NaAc(pH5.2)， 2.5倍体积的冰冷乙醇，混匀， -20℃30分钟。
8、4℃下12000g离心15分钟，小心弃去上清液，用70%乙醇洗涤沉淀，4℃下12000g
离心5分钟。
9、小心弃去上清液，沉淀空气干燥10分钟，或真空干燥10分钟。
10、用少量水溶解RNA液，即可用于cDNA合成（或保存在70%乙醇中并贮存于-70℃）。
[注意] 1、mRNA在70%乙醇中-70℃可保存一年以上。
2、oligo(dT)纤维素柱用后可用0.3mol/l NaOH洗净，然后用层析柱加样缓冲液
平衡，并加入0.02%叠氮钠（NaN3）冰箱保存，重复使用。每次用前需用NaOH水层析柱
加样缓冲液依次淋洗柱床。
第三节 植物病毒RNA提取
大多植物病毒RNA为单链RNA，并且其极性与mRNA极性相同，植物病毒RNA提取
较为简单，一般使用酚氯仿即可获得满意结果。
提纯TMV病毒液（10mg/ml）。
冷冻台式离心机，低温真空干燥仪，电泳仪，电泳槽。
TE-饱和酚:氯仿（1:1），氯仿，3M NaAc(pH5.2)，乙醇(100%和70%)，TE缓冲液，无
RNA酶的双菌水。
四、操作步骤
1、取一eppendorf管加入提纯TMV（10mg/ml）400ml，再加入等体积酚/氯仿，盖紧管
盖后用手充分振荡1分钟，4℃下12000g离心10分钟。
2、吸取水相于一新eppendorf管，再用酚/氯仿抽提，直至水相和有机相交界面无蛋白
3、吸取水相于新eppendorf心管，加入等体积氯仿，用手倒置离心管数十秒，4℃下12000g
离心10分钟。
4、取水相，加入1/10倍体积的3mol/L NaAc(pH5.2)，2.5倍体积的冰冷乙醇，混匀，-20℃30
5、4℃下12000g离心15分钟，小心弃去上清液，用70%乙醇洗涤沉淀，4℃下12000g
离心5分钟。
6、小心弃去上清液，沉淀真空干燥5分钟或空气干燥10分钟，并溶于无RNA酶的双
菌水或TE缓冲液中。
7、取10ml进行电泳分析，另10ml用于cDNA合成。
[注意] 1、整个操作应尽可能在低温下进行。
2、由于病毒RNA镶嵌于外壳蛋白里面，因此要充分剥去病毒外壳蛋白，一般
需要多次进行酚/氯仿的抽提。
第四节 cDNA合成技术
一、 Riboclone M-MLV(H- ) cDNA合成技术
Promega公司的RibocloneR M-MLV(H- ) cDNA合成系统采用M-MLV反转录酶的RNase
H缺失突变株取代AMV反转录酶,使合成的cDNA更长。该系统的第一链合成使用M-MLV
反转录酶,cDNA第二链合成采用置换合成法,采用RNaseH和DNA聚合酶Ⅰ进行置换合成,
最后用T4 DNA聚合酶切去单链末端,方法简便易行。该系统试剂包括：
20μg 特异性引物
200μl M-MLV第一链缓冲液(5×)，配方如下: 250mmol/L Tris?Cl pH8.3(37℃时);
375mmol/l KCl; 15mmol/L MgCl2; 50mmol/L DTT; 10mmol/L dATP, dCTP, dGTP, dTTP混合物
(各2.5mmol/L)
2×625μ rRNasinR RNA酶抑制剂
10,000μ M-MLV反转录酶, RNase H-
5μg 对照RNA
400μl M-MLV第二链缓冲液(10×)，配方如下：400mmol/L Tris?Cl ,pH7.2; 850mmol/L KCl;
44mmol/L MgCl2; 30mmol/L DTT; 0.5mg/ml BSA。
500μ RNase H
500μ DNA聚合酶Ⅰ
100μ T4 DNA聚合酶Ⅰ
2×1.25ml 不含核酸酶的水
以上所有试剂除对照RNA需在-70℃保存外,其余均可保存于-20℃,可以合成40μg
（一） 第一链合成
[α-32 P] dCTP (&400Ci/mmol)，EDTA (50mM和200mM)，TE-饱和酚:氯仿（1:1），7.5M
NH4Ac，乙醇(100%和70%)，TE缓冲液。
2. 操作步骤
(1) 取一灭菌的无RNA酶的eppendorf管,加入RNA模板和适当引物,每μg RNA使用
0.5μg引物(如使用NotⅠ引物接头,使用0.3μg),用H2 O调整体积至15μl, 70℃处理5分钟,冷
却至室温,离心使溶液集中在管底,再依次加入
5×第一链缓冲液 5μl
rRNasin RNA酶抑制剂 25U
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