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分枝杆菌wecA基因的功能研究.pdf 102页
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分枝杆菌wecA基因的功能研究硕士生姓名：指导教师：指导小组：专业名称：金越马郁芳教授辛毅教授生物化学与分子生物学摘要结核病是严重危害人类健康的最严重的疾病之一，自20世纪80年代起，已经受到控制的结核病疫情再次抬头。结核病的致病菌是结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis，Tb)，该细菌具有特殊细胞壁结构，对其生存和繁殖极为重要。其核心结构由肽聚糖、聚阿拉伯半乳糖和分枝菌酸组成。其中聚阿拉伯半乳糖与肽聚糖之间靠L．鼠李糖．D．N．乙酰葡糖胺双糖衔接分子连接。衔接双糖是结核分枝杆菌细胞壁极其重要的结构，破坏这一结构，细胞壁的完整性将遭到破坏从而结核分枝杆菌不能生存。L．鼠李糖．D．N．乙酰葡糖胺双糖衔接分子的合成第一步骤是在一个N．乙酰葡糖胺．1．磷酸转移酶的催化作用下，将GIeNAe．1．P(N．乙酰葡糖胺．1．磷酸)基团转移到C50．P(Decaprenylphosphate)上形成C50?PPGIeNAe。显而易见，在以上的酶促反应中，这个N．乙酰葡糖胺．1．磷酸转移酶起到了非常关键的衔接作用，如果该酶被破坏掉，双糖衔接分子将不能合成。在大肠杆菌(Ecoli)中，WecA酶的功能是作为N．乙酰葡糖胺．1．磷酸转移酶而参与脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)的重要组成成分0．抗原多糖(O．antigenicpolysaceharide，0．PS)的合成。BLAST分析表明，Ecoli的WecA氨基酸序列与MtuberculosisWecA氨基酸序列有27％的相似性，提示Mtuberculosis的WecA很可能也具有N．乙酰葡糖胺．1．磷酸转移酶的活性，可以将GlcNAc．P基团转移到Cso-P上，再接受鼠李糖基完成双糖衔接分子的合成。本文实验的目的是：(1)通过在weeA基因缺陷菌株E．coilMV501导入结核分枝杆菌Rvl302以及耻垢分枝杆菌MSMEG4947基因，验证两个基因编码酶的功能以及利用高效液相和质谱进行酶功能的鉴定。(2)确定wecA基因为结核杆菌生长必需基因。用同源重组方法建立me2l55wecA基因敲除菌株。通过测定wecA基因敲除菌株的生长曲线，研究wecA基因与分枝杆菌生长的关系。利用温度转换实验，造成me2155wecA基因敲除菌株缺乏WecA，通过比对扫描电镜(SEM)和透射电镜(TEM)结果来研究WecA缺乏对该突变株细菌的形态学以及结构的影响。在含有营救质粒的mc2l55wecA基因敲除菌液中加入不同浓度的衣霉素，通过绘制细菌生长曲线来观察衣霉素对WecA酶功能的抑制作用。(3)WeeA酶在不同大肠杆菌宿主中的表达以及酶活性检测。利用表达载体pETl6b携带TbwecA分别转化到不同的大肠杆菌BL21(DE3)，C41(DE3)以及ER2566中。表达WecA蛋白并提取上述各转化茵的膜蛋白，进行点杂交以及Westernblot分析，并在适合条件下与底物一起进行酶促反应，通过高效液相色谱来检测底物UDP．GlcNAe浓度的变化，从而判断WecA是否在不同大肠杆菌宿主中得到表达。本文获得以下结果：1．对wecA基因缺陷菌株E．coliMV501中LPS合成缺陷的补偿以及WecA酶功能的鉴定将pMDl8?SmwecA质粒(pYJ一1)和pMDl8-TbwecA质粒(pYJ-2)电转化到wecA基因缺陷菌株E．coliMV501中，提取LPS并且进行电泳。以未转化任何质粒的MV501以及转化了pUCl8质粒的MV501作为阴性对照。根据电泳结果，可以看到在转化了pYJ．1和pYJ．2的MV501中出现了清晰的LPS条带，而阴性对照细菌中提取的LPS则没有相应的条带。提取上述三种质粒转化的EcoliMV501细菌的膜蛋白。将膜蛋白与底物C50．P以及UDP．GleNAc一起进行孵育，反应上清中UDP．GIcNAc含量的变化通过高效液相以及高效液相．质谱联用仪来检测。检测的结果表明，转化了pYJ．1质粒和pYJ．2质粒的细胞膜蛋白反应体系中，底物UDP．GlcNAe的含量与阴性对照相比有所减少。2．wcgA基因是结核杆菌生长必需基因以及衣霉素对WecA蛋白的抑制作用(1)wecA基因缺陷菌株mc2155YJ．2的构建酶切pUC4K质粒获得Kan抗性基因(KanR)并克隆到pYJ．1质粒中，产生SmwecA：：KanR突变基因。再将突变基因克隆到pPR27．xylE质粒，构建出条件性复制质粒pPR27一xylE．SmwecA：：KanR(pYJ．4)。酶切质粒pYJ．2，获得TbwceA基因，克隆到pET23b．Phsp60质粒的相应位点，构建出pET23b．Phsp60．TbweeA(pYJ．5)质粒。酶切2pYJ．5，将酶切后的片断Phsp60．Tbwec
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