摘要：7月15日，海普洛斯联合创始人兼CTO陈实富博士在由火石创造发起的 “ 走进金域：揭秘分子诊断领域的风起云涌 ” 沙龙上，分享了海普洛斯在3000例液体活检中获得的实践经验，并分析了CTC、ctDNA、外泌体的技术现状和应用情况。

海普洛斯联合创始人，CTO

首先，讲讲CTC技术。肿瘤完成了近端浸润之后，有一些脱落的CTC跑到远端，形成远端转移。如果我们能够更早、更准确地检测CTC，就可以更快地诊断癌症、预测转移。

一种方法是生物化学方法，比如磁珠富集法。阳性分选主要是把肿瘤细胞吸下来，阴性分选主要是把白细胞吸下来。但是，血液里面除了肿瘤细胞、白细胞之外，还有别的细胞。所以，可能特异性不会很好。

另外一种方法是物理方法。微流控分选基于肿瘤细胞比白细胞大的原理，让白细胞通过小孔，肿瘤细胞则通不过，从而留下肿瘤细胞。  

混合测序：可用于靶向药测序和复发检测。单细胞测序：单细胞测序的成本会比较高，但是是一个很精确的分型。这个方向在未来可能会成为主流。体外培养：培养出来的细胞可用于样本实验、癌症辅助诊断、癌症治疗。CTC计数：可用于早期诊断、复发监测等。 

再讲讲外泌体。外泌体比整个细胞小很多，包含很多蛋白、microRNA、RNA、DNA、小抗体和受体等大分子。它有很丰富的信息，但是提取很难。目前，提取的方法分为几种。一种是离心法，包括超速离心和密度梯度离心。另外就是磁珠免疫法、PEG沉淀法。但是，以上这些方法，会慢慢被操作简单的试剂盒提取所取代。

外泌体可以用于DNA测序、RNA测序、蛋白分析，甚至是microRNA测序。目前，外泌体从血液很难捕获到，但在单体里我们可以尝试。整个领域现在还属于比较前沿的状态。 

cfDNA是指所有存在于血液中的游离DNA片段。只有经过测序分析之后，才能找出其中来自肿瘤细胞的ctDNA。我们大概测了3000例cfDNA，有很多统一的数据，可以跟大家分享几个真相。

真相一：cfDNA的长度

 经过分析，发现它的主要长度的峰值在167个bp左右，刚好是绕核小体一圈的长度。使用2*150的pair-end测序，会发现绝大多数是重叠序列。基于重叠序列我们可以做很多分析。 

cfDNA 的起始序列有着其特有的模式，大规模的统计数据十分恒定，表明着它的断裂多来自于酶切效应。

真相三：健康人也同样有很多cfDNA，其中也有不少突变

 健康人cfDNA的浓度并不比肿瘤患者低很多，而且从中同样可以检出基因突变。要准确区分这两者，需要更好的方法。

对于肿瘤患者，cfDNA中的ctDNA，通常占比十分小，属于超低频突变。

这里选了三十个点，最高的比例是17.2%，绝大部分都在1%-2%的水平。怎样把超低频率的DNA变异检测出来，这是我们的技术核心所在。

敏感度较低、检出率有限、只能检测少许已知位点

只能检测已知位点、只能检测少许位点

敏感度低、对突变丰度有很高要求、成本低

可以同时检测大量位点（数百万个）、可以绝对定量。 24cfDNA的应用

通过测序发现靶向药位点变异。

根据cfDNA的变异特征和比例，我们可以预测预后情况，同时监测转移情况。

在肿瘤定性及分型不明情况下，可以帮助确定分型。

这也是我们的梦想。基于肿瘤基因大数据和机器学习，可以明确受测者是否患上肿瘤，甚至可以精确到患什么肿瘤。

ctDNA测序的一些挑战

第一，DNA量很少。一般不超过8毫升血。第二，DNA容易降解。第三，变异丰度很低。一般来说会低于1%，甚至到万分之一、千分之一的级别。第四，测序错误。测序错误可达千分之一。第五，分析错误。比对、VarCall可导致假阳性。第六，解读困难。测完之后要结合临床、结合医生知识、结合生物知识、结合大数据、结合模型、结合数据库，才能给出一份全面准确的报告。 实践经验分享

1、超微量捕获、平行扩增

我们首先做的是超量捕获、平行扩增。血液里的DNA不多，需要尽可能把它抓出来，抓得越少，越可能产生假阴性，所以我们做了很多的超量捕获的方法，研发了许多试剂盒。

2、超深度测序 + 单分子编码

刚刚提到测序是会有错误的，变异率大概在千分之一到百分之一的水平，那到底如何区分真正的肿瘤变异和测序错误呢？这是很难的一个问题，我们也用了很多方法改进。从一开始使用常规的ctDNA测序，到后面使用QctDNA测序，到最后采用单分子编码测序。经过这些改进，我们已经可以更准确地获取变异，区分它是真阳性还是假阳性。

3、软件研发：全自动质控 + 过滤流程

我们已经开发了超过10个软件。我们在做肿瘤检测的时候，更关注超低频突变。怎么样去除测序的错误和噪声，这其实是一个很难但很关键的问题。所以我们做了一个全自动质控和数据过滤平台，重新写过了流程和代码，过滤掉一些测序错误。同时，我们做了OpenGene，这是一个基础库。还做了检测融合的FusionrDiect、变异扫描的MutationScan和模拟测序的软件，包括SeqMaker。

4、系统研发：肿瘤+基因+变异+药物 知识库

癌症诊断是一个很大的工程，需要结合临床知识、生物知识、基因组知识。在我们开发的一个知识库系统（HaploX）里输入变异，就能自动反馈治疗、检测、监测等一系列方法。同时，我们也开发了很多存储、分布式计算、知识存储的系统，以及全流程测序平台管理，我们称为HapLab。

我们发起的OpenGene的开源项目，已经包含了超过8个子项目。包括刚刚说的测序质控管理、AfterQC、OpenGene，还有融合检测，还有SeqMaker，都是里面的一部分开放代码。

6、中国首个大型癌症基因测序计划：万人计划

2015年的7月，我们跟深圳市人民医院发起了万人癌症基因组测序计划，这是国内的首个大型计划。这个计划我们已经测完超过3000个人。以后，我们会建立一个万人的癌症数据库。

7、建立中国人癌症基因数据库

今年3月份，我们拿了一个深圳市政府的项目——做一个中国人自己的癌症数据库。由深圳市科创委支持几百万，我们自己再投入几千万，去搭建这个癌症基因大数据平台。我们会把更多的测序数据，结合临床的表型数据，去做挖掘和信息分析，然后融合成数据库，再将有用的信息开放给行业里合适的机构。

友情提示：嘉宾观点不代表火石创造立场。

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