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【求助】为什么连接总是连不上？
我的目的片段是用pyrobest扩增的，因为其末端没有A，所以将其连在全式金公司生产的钝端载体pEASY-Blunt上，酶切和测序都正确。接下来就要将目的片段连到中间载体pE***3C上，将pE***3C和pEASY-Blunt－目的片段这两个质粒用BamHI和EcoRI做双酶切，回收2.5K的载体片段和1.5K的目的片段，做连接，目的片段和载体片段的摩尔比为5：1，16度过夜连接，用的是TaKaRa的T4连接酶，已经连了三次了，只长过一个菌落，提质粒鉴定发现还不是。该怎么办呢？急死了！建议换别的比列，重新连，可以同时用几个比例连。3：1，8：1或者10：1等。才三次，就着急，我都30次了还是没有连上，比你更急！切记，要多尝试！一、目的片段和载体片段的摩尔比很重要，但你的载体片段有多少pmol,应该有一定的pmol数，一般要0.03-0.1pmol，不能太低，不知道你的量有多少。换一下连接buffer，时间长加上反复冻融会很快失效，建议用新的。二、载体片段和目的片段的质量也很重要，想一下是否你的回收的质量怎样，是用什么方法得到的，如果质量不好，也是很难得到重组子的。另外，可以用载体上的引物用连接液做一下PCR检测一下连接效果。载体片段和目的片段的比例虽然重要，但载体片段和目的片段的质量更重要，我曾做过载体片段和目的片段的比例1：1的时候，连接效率也不错。切记载体片段和目的片段的质量。我查看以前的记录，构建别的载体的时候还用过载体和片段比例3：1，好像当时把比例搞反了了，不过也连的很不错，而且长出的菌落基本全是对的。这次试了个载体和片段比例1：5和1：3，虽然菌落长了，但还是少，每板只有四五个，酶切鉴定后却都不正确。真是愁人啊！我这个是一个粘端一个平端的将目的片段和载体连接，怎么会这么难连呢？对了，我用的载体和片段浓度大约均为80ng/ul,载体大小为3。7K，片段1。5K不好意思，我的载体和片段浓度大约为50ng/ul载体大小为2.4K片段1.5K谢谢各位帮忙！不胜感激！在确保你的连接酶和感受态细胞都没有问题的情况下，建议：全部用新的电泳缓冲液和柱子重新回收目的片段和载体，保证质与量，连接反应4度过夜。不要用以前回收的一直连接，没用的！应该很好连接的4度过夜？不是16度吗？我连过2500bp的片段，也没有很难连，我用的是NEB的连接酶，很好用的，我一般是16度连接24小时，然后4度过夜！第二天转化，如果感受态不好的话，可以购买大连宝生物的感受态，我用着还不错！你可以尝试一下！相信你会做出来的！加油！BamHI和EcoRI做双酶切后都产生粘端，不知“我这个是一个粘端一个平端的将目的片段和载体连接”是怎么说？如果是平端连接，效率会比较低，首先你要确保回收的纯度，平端的连接对于离子浓度很敏感，此外你可以加入PEG800、增加酶量，这样可以大大提高连接效率。关键问题是感受态好吗？用5ng左右的质粒转一下看看。片断回收后电泳定性（半定量）看看就可以啦，摩尔比不需要太精确，也做不到那个精度。按照说明书上说的，takara的连接酶16度半小时都可以，我一般连接半小时到3小时。如果来不及就放4度过夜，次日再用。哦，我发贴时写错了，用的是BamHI和EcoRV,所以是一个 粘端一个平端感受态我用的是TianGen的，就是以前的天为时代。连接酶我们实验室也有NEB的，不过好像至少已经买了有差不多两年了，还能好用吗？真是谢谢大家这么热心帮忙啦！你们实验室好阔气，我们都是自己做感受态，冻到－80，用将近一年我也陷入了同样的困境，连了n多次了，应该超过10次了，总是只有很少的菌落生长，而且鉴定后正确的几率几乎等于0，急啊。我的片段&1kb,而且提取后跑电泳显示量很多，所以我想应该不存在量的问题。质量方面我觉得我每次重复提取的时候都很小心，而且以前有过同样的经验，做出来的效果很好。这次不知道怎么回事，好惨啊不是阔气，是浪费，唉！我去年一次构建了4个载体，都相当的顺利，这次也不知道是怎么了，总是频频出问题。多做对照实验吧，一步一步确定没有问题的步骤，最后把问题限定在一个环节上。确定感受态没问题，可以考虑转5ng质粒或者其他能定性的东西。用你的连接酶和buffer连接肯定能连接上的东西（连接试剂盒里送阳性对照）鉴定阳性克隆一般不要提质粒，太累，用牙签在菌落上粘点，做pcr。hanyueting999 您好！不知您的实验现在进行的怎么样了？连接不上通常需要考虑以下几方面原因：1、连接酶及所用的缓冲液
a、所用的连接酶活性不好；
b、连接酶需要ATP的存在，而ATP在常温或高温条件下容易***破坏，所有Buffer应该尽量新鲜。如果您的缓冲液时间太长，建议您可以换一支新的Buffer试一下。2、感受态细胞
感受态细胞反复冻融或者时间太长，转化效率降低。可以重新制作一批感受态细胞。3、DNA。
a、酶切。这一步还是很重要的。有的内切酶纯度不高，其中有一些核酸内、外切酶的污染，这样就会在酶切过程中在切割产生的末端上又切掉几个碱基，而如果有这种情况，电泳又根本检测不出来，所以再进行连接时，就始终连接不上。
b、纯化。应保证纯化的DNA的质量，如不含盐、EDTA等的污染。因为连接酶连接时需要Mg离子，如果混有EDTA的话，就会抑制反应。
c、用量。连接时DNA的用量不要太高，建议体系中总的DNA浓度为1-10ug/ml。4、连接反应体系
不建议用太大的体系，一般10-20ul即可。建议您连接不上的时候，不要总是在原来的基础上不断去重复。您可以将所有需要注意的环节重新来过。希望会对您的实验有帮助。补充一下：像您这样的粘端定向连接，应该是问题不大的。以上主要是从连接本身分析，其他还有：载体：目的片段=1:3-1:6应该可以了，如果目的片段比例太高容易造成串连，而使DNA无法正常环化。平板抗生素正确与否，抗生素浓度是否合适等等。
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3秒自动关闭窗口为什么英雄联盟登录不进去，连官网都进不去！〈碧云轩-QQ问题解答论坛
[QQ游戏]：为什么英雄联盟登录不进去，连官网都进不去！陈鹏QQ：保密首先，我这边网络是没问题的。其次，我电脑也是没问题的。但是就最近这一个月，每次回到家想玩玩LOL，都是登录不上去，选择了大区跳转到游戏界面的时候，就在哪里卡住，然后弹个对话框出来说什么：“因为未知原因，无法登录”。请问这个问题应该怎么解决！并且现在是连官网都进不去，我进其他的网站，没几秒就OK了，进LOL官网就是半天才给我弹出一个因为网络原因什么的，无法连接！我强调下。我的网络是完全没问题的！求速解！！！！谢谢！！！！！　　第 1 楼[ 发表时间： 22:02:51 ]
[QQ游戏]：回复：为什么英雄联盟登录不进去，连官网都进不去！管理员QQ：保密换个时间试试。　　第 2 楼[ 发表时间： 18:16:36 ]
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