大侠们这个该怎么办啊教我一五一十的教（侠盗飞车4）
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编辑：lianxueping
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【求助】关于MTT的疑问，请大侠们过来答疑，尚未解决！
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这个帖子发布于4年零302天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
1、接种细胞后，换加药培养液，对与加药的培养液，血清浓度对于最终结果有什么影响，具体原因是什么？个人感觉，如果改变血清浓度本身对细胞增殖就是一种影响。细胞贴壁后是否需要将悬浮的细胞吸掉？2、药物处理完，加MTT前是否需要吸出培养液并且洗，用pbs洗可以不，或者是要用培养液洗？3、加dmso前必须洗，因为怕洗不干净残留培养液？用pbs洗可以不，或者是要用培养液洗？4、酚红对mtt实验的哪一步有影响？有必要用无酚红的培养液吗？5、药物处理期间，换液频次是怎么要求的？好像涉及到药代代谢和稳定情况。6、DMSO溶解后，是立即上酶标仪还是避光室温2-4小时或者过夜？
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附：MTT主要用途和使用方法MTT主要有两个用途1．药物（也包括其他处理方式如放射线照射）对体外培养的细胞毒性的测定； 2．细胞增殖及细胞活性测定。 检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲?（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲?，用酶标仪在490nm波长处测定其光吸收值，在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。根据测得的吸光度值（OD值），来判断活细胞数量，OD值越大，细胞活性越强（如果是测药物毒性，则表示药物毒性越小）。贴壁细胞1、收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100ul，铺板使待测细胞调密度至孔，（边缘孔用无菌PBS填充）。 2.、5%CO2，37℃孵育，至细胞单层铺满孔底（96孔平底板），加入浓度梯度的药物，原则上，细胞贴壁后即可加药，或两小时，或半天时间，但我们常在前一天下午铺板，次日上午加药.一般5-7个梯度，每孔100ul，设3-5个复孔.建议设5个，否则难以反应真实情况 3.、5%CO2，37℃孵育16-48小时，倒置显微镜下观察。 4、每孔加入20ulMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4h。若药物与MTT能够反应，可先离心后弃去培养液，小心用PBS冲2-3遍后，再加入含MTT的培养液。 5、终止培养，小心吸去孔内培养液。 6、每孔加入150ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值。 7、同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜）悬浮细胞1、收集对数期细胞，调节细胞悬液浓度1×106/ml，按次序将：①补足的1640（无血清）培养基40ul；②加Actinomycin D（有毒性）10ul用培养液稀释 (储存液100mg/ml，需预试寻找最佳稀释度，1:10-1:20)；③需检测物10ul；④细胞悬液50ul（即5×104cell/孔），共100ul加入到96孔板（边缘孔用无菌水填充）。每板设对照（加100ml 1640）。 2、置37℃，5%CO2孵育16-48小时，倒置显微镜下观察。 3、每孔加入10 ul MTT溶液（5 mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4 h。（悬浮细胞推荐使用WST-1，培养4 h后可跳过步骤4），直接酶联免疫检测仪OD570nm（630nm校准）测量各孔的吸光值） 4、离心（1000转x10min），小心吸掉上清，每孔加入100 ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD570nm（630nm校准）测量各孔的吸光值。 5、同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜），每组设定3复孔。
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1.关于药物试验时，加不加血清，我是加的，用得就是平常养细胞的培养基，以前实验室也有人用2％，这个没有定论的，自己觉得，细胞在营养差的条件下对药物会更加敏感。2.用培养基或者PBS洗，洗的过程中会使一些贴壁不是很牢固的细胞下来，反而影响试验结果，没有必要吧。3.加DMSO前，更加不能洗，因为形成的结晶很容易洗掉，在加了MTT后孵育完吸的时候要小心，注意不能把下面的吸上来。4.我一直用含酚红的培养基，也没关系，注意有些药物可能会影响MTT的结合，用之前注意下。5.换液，这个和药物的稳定性有关，可以做个预试验看看，关于MTT，版内有很多资料的，看看，总能得到自己想要的结果的。
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xchen 1.关于药物试验时，加不加血清，我是加的，用得就是平常养细胞的培养基，以前实验室也有人用2％，这个没有定论的，自己觉得，细胞在营养差的条件下对药物会更加敏感。2.用培养基或者PBS洗，洗的过程中会使一些贴壁不是很牢固的细胞下来，反而影响试验结果，没有必要吧。3.加DMSO前，更加不能洗，因为形成的结晶很容易洗掉，在加了MTT后孵育完吸的时候要小心，注意不能把下面的吸上来。4.我一直用含酚红的培养基，也没关系，注意有些药物可能会影响MTT的结合，用之前注意下。5.换液，这个和药物的稳定性有关，可以做个预试验看看，关于MTT，版内有很多资料的，看看，总能得到自己想要的结果的。谢谢妹子。你的意思是全程都不用洗，这点保留意见。1：有些药物（抗氧化剂或者说还原剂）会和mtt直接反应，如同你说“注意有些药物可能会影响MTT的结合，用之前注意下”，所以加mtt前需洗，换用普通培养液后再加入mtt孵育4小时。不然做出来的结果是相反的，可以在加MTT之前镜检观察处理组和阴性对照。这这种情况下有没有必要用额外的孔来测试mtt和药物的显色了？这样就有4组：药物处理组、阴性对照组、空白组、mtt和药物组；2、加dmso前必须把酚红清除干净，否则吸光度受影响。也有观点是因为在最后去除上清时，每个空肯定都会有残留，调零就是要扣除这些残留。第二个问题：药物在细胞培养环境一般有有两种结果：被摄取、被降解，存在一个药物代谢的问题，尤其是不稳定的药物依赖于代谢产物起作用，这样的话我该如何设定换液时间了？
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