病 　　毒 　　学 　　报

SPF鸡胚中内源性白血病病毒全基因序列鉴定与分析

1. 山东农业大学 　动物医学院 ,泰安 　. 山东博莱威生物技术研究所,滨州 　256606

摘要:摘要 :以国内某 3家 SPF 鸡场的 SPF 鸡胚成纤维细胞提取的基因组 DNA为模板 ,参照已发表的序列 ,设计

合成了 4对检测内源性白血病病毒引物 ,分别检测 gag基因、pol 基因、env 基因和 L TR 片段 ,结果显示 4者检出阳

。设计合成了 8对引物 ,选取 4 片段检测均为阳性的样

品之一 ,经 PCR成功扩增出了 8段连续的、相互部分重叠的目的 DNA片段 ,分别连接入 T 载体进行克隆测序。用

DNAstar 软件对测序结果进行拼接,从一个鸡胚得到了内源性白血病病毒前病毒全基因组序列。比较分析发现 ,

基因与已知的 E亚群内源性病毒代表株

基因的核苷酸序列同源性在 9815 %以上 ,全基因组序列同

源性在 9911 %以上 ,而与其他亚群代表株同源性相对较低 ,

关键词 :内源性白血病病毒;全基因组核苷酸序列;同源性分析

基金项目:山东省科技攻关计划

,男,山东临淄籍 ,在读硕士 ,主要从事

主要引起禽各种造血细胞肿瘤性增生 ,为反转录病

毒。由于其中一些毒株最先分离于所谓的 Rous 肉

。目前 ,已有 A～J 10 个亚群得到了分离

鉴定。分离自鸡的 ALV属于 A、B、C、D、E 和J 亚

群。鸡的 E 亚群 ALV通常认为属于内源性白血病

病毒 ,而 F、G、H、I 亚群也为内源性ALV ,但宿主不

是鸡。鸡的内源性病毒样成分包括内源性病毒

位点、中等重复序列 E***

、来自鸡基因组的禽反转录转座子 ART2

以及高度重复序列 CR1

。鸡体内的内源性反转录病毒样成分是真核生

物中存在大量反转录成分的典型例子 ,通常认为 E

亚群 ALV代表来自细胞内可移动的遗传成分

的反转录病毒的进化阶段 ,而其他成分则被认

为是外源性反转录病毒退化的前病毒体 ,由于突变

而失去了产生感染性病毒的能力。这些成分存在的

实际意义是目前很多研究的主题。

相关研究已阐明禽白血病病毒与人类健康之间

,虽然没有强有力的证据说明ALV 对

人类公共卫生构成威胁 ,但通过酶联免疫试验和免

技术 ,可以从鸡场工人体内

检测到滴度较低的 ALV抗体

方法 ,可从商品蛋的蛋清中检测到有内源性和外源

。这说明 ALV对人类健康可能

存在潜在的威胁。近年来 ,ALV与其他免疫抑制性

病毒混合感染日趋严重 ,致使鸡群的免疫抑制以及

肿瘤发生率逐年增高 ,由于 ALV在普通鸡群中广

泛存在 ,所造成的免疫抑制给养鸡业带来的损失不

可估量。国内用于疫苗制造的 SPF鸡胚是否存在

内源性病毒 ,若存在病毒是否会通过疫苗对鸡群造

成免疫抑制 ,一直是禽病研究人员关注的课题。

1 　实验材料 　SPF 鸡胚购于国内3 家SPF 种鸡场,鸡品种

为白来航鸡。细胞培养基 M199购自美国 Invitrogen公司。

胰酶购自德国 MERCK公司。工具酶、克隆用载体 pMD182

T 为日本TaKaRa 公司产品,凝胶回收试剂盒为美国OME2

GA 公司产品。核酸探针标记及检测试剂盒为德国 Roche

公司产品。其他常规试剂为国产分析纯。

2 　引物设计及基因组 cDNA 的PCR扩增 　根据已发表的

ALV 序列,设计了4 对检测引物,分别检测L TR 片段、

基因;设计了覆盖整合线形 ALV基因组 cD2

NA 的全序列的8 对连续且相互重叠的引物

,用于从同一个鸡胚中样品中扩增ALV 基因组cDNA

针对 ALV 可能形成的环形结构进行扩增 ,全部引物委托上 海生工生物工程技术服务有限公司合成。引物序列见表 1。

表 1 　引物核苷酸序列

培养至形成良好的单层。将 CEF用 0125 %的胰酶

DNA ,TE 缓冲液复溶后作为PCR 扩增的模板。按常规体

3 　目的核苷酸片段克隆和测序 　各段 PCR产物分别经琼

受态宿主菌 ,筛选的阳性克隆交由上海生工生物工程技术服

务有限公司进行 DNA序列测定。为排除 PCR过程可能出

现的碱基错配 ,每段片段选取 3 个克隆进行测序。

4 　探针标记及核酸探针杂交 　将测序完成的质粒

进行酶切反应 ,琼脂糖电泳 ,试剂

盒分别回收含检测L TR 片段、gag 基因、pol 基因和

片段。分别将回收的目的片段

记 ,验证其敏感度达 10

基因的 PCR产物分别进行相应的核酸探针

杂交 ,以验证 PCR 检测所检出的阳性为特异性扩增。

1 　PCR扩增及核酸杂交结果

利用4对检测引物以 CEF 全基因组DNA为模

板进行 PCR扩增反应 ,琼脂糖凝胶电泳结果表明 ,

显示 PCR 检测产物均为特异性扩增

片段检测均为阳性的比例为 16/ 46。

利用 8对用于扩增 cDNA的全基因组引物 ,以

四片段均为阳性样品之一为模板 ,进行相应的 PCR

扩增反应 ,琼脂糖凝胶电泳结果表明 ,成功地扩增出

了 8段与预期大小相符的 DNA片段

病 　　毒 　　学 　　报 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　24 卷 　

PCR 扩增片段的阳性克隆经SDS 碱裂解法小量提

取质粒、限制性内切酶双酶切鉴定 ,各阳性克隆的插

图 1　PCR 检测产物及全基因组cDNA 扩增产物018 %琼脂糖凝胶电泳图

图 2 　点杂交验证 PCR 检测结果图

尝试摸索变换了多个 PCR 反应条件 ,但并未得到目

2 　检出的内源性白血病病毒的基因组核苷酸序列

参照已经发表的内源性白血病病毒基因组序列 ,利

进行剪切拼接 ,得到了禽内源性白血病病毒 SD0501

的全基因组 cDNA核苷酸序列。该 序列 全长

已发表的相应序列中的不同基因比较 ,3个主要

ORF 编码的基因序列的起止位点和长度分别为:

3 　SD0501 株cDNA 全基因组与相关基因组结构的

ALV 毒株甚多,选取了亚群代表性毒株进行比

他毒株存在一定的差异 ,图 3显示了与目前流行

没有互相重叠 ,这与反转录病毒科的一般基因构成

　1 期 　　　　　　　　　　孔义波 等:SPF 鸡胚中内源性白血病病毒全基因序列鉴定与分析

和增殖特征是不吻合的。

4 　SD0501 株cDNA 全基因组序列与已知相关毒株

发表的不同亚群代表毒株的相应基因组核苷酸序列

得知:L TR序列与其他亚群毒株存

在较大的差异 , gag 基因、pol 基因在不同亚群间也

显示了高度的同源性。而决定亚群特异性的 env基

因在不同亚群亦显示了较大的差异 ,同源百分比为

的同源百分比却高到 9815 %～9913 %。通过比较

比最高 ,可以确定本研究所得到的 SD0501 是一株

表 2 　ALV/ SD0501 株与不同亚群的代表株的核苷酸序列同源性比较结果

本研究测定了内源性白血病病毒 SD0501株的

报告的估计值相符。该序列中 L TR全长

度为 279nt ;3 个主要 ORF编码的基因序列长度分

将 SD0501 株相关的各段序列与文献中已发表

的不同 ALV毒株的相应序列进行同源性比较 ,发

之间核苷酸序列同源性很高 ,而不同亚群 ALV的

病 　　毒 　　学 　　报 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　24 卷 　

L TR 和 env基因在核苷酸和氨基酸水平上则存在

较大差异 ,相同亚群的不同毒株间差异较小 ,据此将

弱与 ALV的致瘤性的强弱密切相关 ,而内源性病

毒的致肿瘤作用很弱 ,SD0501株与 ALV内源性毒

到 9617 %以上 ,而与其他亚群株的同源性相对较

能也很弱。另外 ,本研究所得到的 SD0501 株的基

因组结构中 , pol 基因与 env基因没有相互重叠 ,这

报告是相符的 ,但与反转录病毒科

的一般基因构成和增殖特征不吻合 ,这样的结构对

该病毒生物学特性有怎样的影响 ,还有待于进一步

ev 位点的基因序列与E 亚群ALV 有关,整合

到鸡体基因组中的 ev 基因可由亲代向子代遗传 ,而

充分表达的传染性内源性病毒有时也可以水平和垂

。当完整的内源性病毒基因组存在时 ,细

胞可能自发的或经化学物质如溴脱氧尿核苷

诱导后产生出 E 亚群 ALV。内源性病毒

时 ,存在的基因可在细

胞内进行表型表达 ,虽不能产生感染性病毒 ,但可能

造成 EL ISA 检测、禽白血病补体结合试验

遗传缺陷型病毒不能产生感染性病毒粒子 ,但有些

则可在鸡肧或孵化的雏鸡表达出感染性的病毒 ,这

对养禽业的健康发展形成潜在的巨大威胁。

反转录病毒在其前病毒 cDNA发生整合前有

,据此,设计合成了针对环形结

中变换了多个 PCR 反应条件均未扩增到目的片段。

未扩增到理论上的长片段。据此推测 ,该鸡肧中没

有游离出来的病毒粒子 ,或者有游离病毒粒子存在 ,

但并未处在环形的特殊时期 ,亦或者含有的环形病

毒粒子的量极其微小 ,目前用常规 PCR方法检测不

同一品系的鸡中可能含有多个 ev基因位

基因的检测结果的不完全一致性也证实了这一观

点。由于 ALV在鸡群中广泛存在 ,而内源性 ALV

可能更为广泛 ,但目前还没有确凿的证据说明内源

性 ALV在养鸡业中的危害作用。本研究完成的内

源性白血病前病毒全基因组核苷酸序列 ,为了解国

内内源性 ALV流行毒株的来源、与国外分离株的

差异及今后的传播、演变提供了参考 ,也为今后研究

ALV 的不同基因及其功能的后续工作奠定了基础。

　1 期 　　　　　　　　　　孔义波 等:SPF 鸡胚中内源性白血病病毒全基因序列鉴定与分析

病 　　毒 　　学 　　报 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　24 卷