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...双水相体系的相图？ 双水相萃取的原理是什么？ 特点是什么...【精选-PPT】
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...双水相体系的相图？ 双水相萃取的原理是什么？ 特点是
官方公共微信实验二 双水相萃取α淀粉酶分配平衡 三亿文库
实验二 双水相萃取α淀粉酶分配平衡
实验二 双水相萃取α-淀粉酶的分配平衡实验 一、实验目的与要求 1）掌握双水相萃取技术的基本原理和主要影响因素。 2）了解目标产物的性质如等电点、电荷和分子量等。 3）掌握熟悉聚乙二醇（PEG）/硫酸铵体系双水相萃取实验操作。 4）明确PEG分子量、硫酸铵浓度、pH和添加NaCl等因素对α-淀粉酶分配系数的影响。 二、实验器材和试剂 1. 实验器材:低速离心机；酸度计；涡流混合器；分光光度计 2. 实验试剂:PEG：（分子量分别为、、8000）、硫酸铵、α-淀粉酶、 磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氯化钠、考马斯亮蓝 G-250 三、实验原理 双水相萃取技术在萃取胞内酶中应用广泛，最常采用的双水相体系是PEG/Dex或PEG/低分子盐系统，其中低分子盐最常采用的是硫酸铵、磷酸钾和硫酸镁。
PEG/磷酸钾双水相体系相图如上所示。T为上相浓度，B为下相浓度, C为系统临界点，TCB为临界线或双节线，双节线以上为两相区、以下为一相区或均相区。因此两相浓度要足够高才可以形成两相。双水相萃取分配系数K=Ct/Cb，为上相和下相的浓度比。 双水相系统分配系数的影响因素包括系统本身的因素如系统组成、聚合物分子量、聚合物浓度、盐和离子强度、pH等，以及目标产物的性质如疏水作用、电荷、等电点和分子量等。利用双水相技术可以获得特定蛋白质和生物大分子的最适宜分离的相系统和最优分配。 相图中TMB为系线，其长度由相组成的总浓度决定，表征两相差异程度。在临界点附近系线长度趋近于零，表示上相和下相的组成相同，因此分配系数应为1。随着PEG、硫酸铵和盐浓度增大，系线长度增加，上相和下相相对组成的差别就增加，酶在两相中的分配系数会受到极大的影响。 本实验采用PEG/硫酸铵双水相体系研究α-淀粉酶的分配，具体研究PEG分子量、硫酸铵浓度、pH和添加NaCl浓度对α-淀粉酶分配系数的影响。 参考：-淀粉酶是广泛应用的生物酶类，B.Subtilis细菌α-淀粉酶是研究和应用较多的α-淀粉酶，其分子量为48 KD，PI约为5，最适pH5.3-6.4，在pH4.8-8.5之间稳定。 四、实验步骤 1.
PEG/硫酸铵双水相体系相图绘制（全班都做） 配制40%PEG1000和43%硫酸铵原液（没有混合前的液体，混合后浓度是相图中最终浓度），分别取
0.7gPEG、原液（PEG00、6000密度分别为1.037g/mL、1.066 g/mL 、1.03 g/mL 、1.07，因此加入0.7g对应体积分别为0.68 mL、0.66mL、0.68 mL、0.66 mL），加入0.5mL水，按图1流程绘制相图，按表1记录数据。注意少量多次加入硫酸铵原液，系统出现浑浊时记录加入硫酸铵体积，计算重量（43%硫酸铵原液密度为1.2g/mL）,再加入适量水，使体系变澄清，计量加入的水，再加硫酸铵，使系统再次变混浊，如此反复操作，原液冰箱放置。将数据记录到表1中，计算系统混浊不同时刻PEG和硫酸铵在系统中的质量百分浓度（或质量体积百分比），绘制PEG和硫酸铵的双水相相图。 第1组同学做PEG分子量1000的相图，第2、3、4组分别做PEG分子量和6000的相图。
HO 2 0.5ml
混和 记录(NH4)2SO4
H2O 0.3/0.5ml 混均 旋涡器 浑浊 澄清
PEG/硫酸铵双水相相图绘制流程 表1
PEG/硫酸铵双水相体系相图绘制数据 次数 1 2 3 4 5 6 H2O加量 (NH4)2SO4溶液加量 （g） 0.5 0.3 0.3 0.3 0.5 0.5 （mL）
纯（NH4)2SO4 溶液累计 PEG4O00(%) (NH4)2SO4(%) 累计量（g或mL） 总量（g或mL）
不同PEG分子量对双水相萃取α-淀粉酶分配系数的影响（第1组）
按图2流程，配制40%PEG、和50%硫酸铵原液，混合后双水相体系为PEG4000 (20%g/mL) 硫酸铵(25%g/mL)。分别取4mL PEG和硫酸铵原液各2份，一份做上下相空白样，加入0.5mL水，另一份加入0.5mL淀粉酶用于双水相分配）置于15mL刻度离心管中轴向充分混合，3000r/min离心4min，读出上下相体积，计算相比。 小心吸取上相1mL,加入3mL考马斯亮蓝，测定595nm下的吸光度A值。移去上相，弃去相界面处液体和少量下相，小心吸取下相1mL,加入3mL考马斯亮蓝，测定595nm下的吸光度A值。添入表2，计算分配系数,绘制趋势图。（实验2、3、4、5步骤均采用此方法测定上下相吸光度值，根据蛋白浓度标准曲线方程计算出酶浓度）标准曲线方程 Y= 0.8292 X + 0.0272
PEG2000 (NH4)2SO4 4.00mL 4.00mL 淀粉酶 0.5ml
15ml刻度 离心试管 R =V上/V下
振摇混和 (固体溶解) 3000转/分 4 min 求蛋白质 分配系数
K = C上/ C下 台称 总重8.5mL 图2 不同变量对双水相萃取α-淀粉酶分配系数影响操作流程 表2
不同PEG分子量对双水相萃取α-淀粉酶分配系数的影响
分子量（D） 上相酶吸光度 上相酶浓度 00 8000
下相酶吸光度
下相酶浓度
3．添加不同浓度NaCL对双水相萃取α-淀粉酶分配系数的影响（第2组） 分别取4mL40%PEG4000和50%硫酸铵原液8份，按表3加入不同NaCl浓度后，空白样加入0.5mL蒸馏水，样品加入0.5mL淀粉酶置于15mL刻度离心管中轴向充分混合，3000r/min离心4min，读上下相体积，计算相比。按步骤2测定上下相中淀粉酶吸光度，按标准曲线计算浓度和α-淀粉酶分配系数。 表3
添加不同浓度NaC]时α-淀粉酶分配系数 NaCl浓度w/w 上相酶吸光度 上相酶浓度
下相酶吸光度
下相酶浓度 分配系数
l.0% ( 0.085g)
2.5% (0.2125g)
4.不同硫酸铵浓度对双水相萃取α-淀粉酶分配系数的影响（第3组） 表4
不同硫酸铵浓度对α-淀粉酶分配系数 硫酸铵浓度 g/mL 上相酶吸光度 上相酶浓度 20.0%
30.0% 40.0%
下相酶吸光度 下相酶浓度
取4mL40%PEG4000
8份，按表4分别加入不同浓度硫酸铵原液各2份，空白样加入0.5mL蒸馏水， 样品加入0.5mL淀粉酶置于15mL刻度离心管中轴向充分混合，3000r/min离心4min，读上下相体积，计算相比。按步骤2测定上下相中淀粉酶吸光度，按标准曲线计算浓度和α-淀粉酶分配系数。 5.不同pH值对双水相萃取α-淀粉酶分配系数的影响（第4组） 取4mL40%PEG4000
8份，按表5分别加入不同pH值含50%硫酸铵原液各2份，空白样加入0.5mL蒸馏水，样品加入0.5mL淀粉酶置于15mL刻度离心管中轴向充分混合，3000r/min离心4min，读上下相体积，计算相比。按步骤2测定上下相中淀粉酶吸光度，按标准曲线计算浓度和α-淀粉酶分配系数。 对于PEG4000 (15%g/mL) 硫酸铵(25% g/mL)体系，按表5记录不同pH值时α-淀粉酶分配系数。 表5
不同α-淀粉酶浓度时α-淀粉酶分配系数 pH值 4.8 5.5 7.0 8.5
五、实验注意事项 上相酶吸光度
上相酶浓度
下相酶吸光度 下相酶浓度
1．加完物料后必须将离心试管沿轴向充分振摇，直至固体全部溶解。 2. 上下相分离时注意吸管小心吸出上相，将多余上相和少量下相弃去，换吸管，吸出下相。 六、思考题 1．常用双水相体系有哪些？
2．双水相体系形成的过程？ 3．双水相体系形成的原因？ 4．分析PEG分子量、浓度、pH、添加NaCl和酶浓度等因素对α-淀粉酶分配系数的影响。 %%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%% 1. 穿实验服、预习实验、不要大声喧哗。 2. 下午一点半2个班同时到实验室，1班在607,2班在608.统一在608讲解后分别做实验。 3. 每组任务：相图，一个变量对分配系数的影响，1-4组分别做步骤2、3、4、5. 4. 为避免分光光度计使用时间冲突，每班第1组先做变量影响，每45分钟后轮换下一组使用。 5. 每组选组长领药品，实验结束后洗干净交回。每班第3-4组值日。签到后检查无误给成绩。 %%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%% 准备试剂：（4个班） 40%PEG、 各200mLL。 (试剂瓶装每个2瓶) 43%硫酸铵原液500mL,每组分成4个小试管分装，每管4mL。 50%硫酸铵原液150Ml,每组分成4个小试管分装，每管4mL。 pH值分别为4.8、5.5、7.0、8.5的磷酸盐缓冲液100mL.（用于配50%硫酸铵原液每组各4mL,共4组） NaCl浓度0.085g、0.2125g、0.425g、0.663g，各4份,共4组。 考马斯亮蓝 G-250 800mL, 每组100mL.（100mg考马斯亮蓝、85%磷酸120Mml\\95%乙醇50mL,定容至1L） 1%α-淀粉酶10mL（每组4份，每份0.5mL装在1mL离心管中） 20%、30%、40%、50%硫酸铵各100mL.（每组各4mL） 玻璃器皿：（按每组算，全班8组） 每组小试管8+16=24个。不足可以用4mL离心管代替。
每组移液管0.5 mL、1.0 mL各5个. 每组洗耳球 2个，试管架（铝1个，***大试管架1个）15mL刻度离心管 每组4个。 比色皿每组8个，每班轮流使用。胶头滴管4个。10mL量筒1个。
仪器设备：低速离心机、分光光度计、电子天平各2台
联系***：cand57