大鼠心肌细胞分离和基因表达的实验研究--《北京协和医学院》2011年硕士论文
大鼠心肌细胞分离和基因表达的实验研究
【摘要】：背景：心肌细胞转录水平是心脏病领域的重要研究方法,帮助认识疾病的发病机制。传统研究所用的对象多是心肌组织,但是在正常的心室壁组织中,除心肌细胞外,还有成纤维细胞、平滑肌细胞以及其它类型细胞,这些细胞存在会对分析心肌细胞基因表达水平造成很大的干扰。所以我们更需要分离心肌细胞后再进行基因表达分析。既往许多研究者设计过不同的分离心肌细胞的方法,但均有各种的不足,如对于操作技术、设备要求较高、分离时间过长、细胞得出量较少等。酶解法是一种常用的分离心肌方法,但技术操作细节的差异使其分离的结果不尽一致,且尚无对于分离后提取RNA进行基因表达分析的效果进行详细的研究。本文将对该方法进行深入研究,并进行转录水平分析,为进一步使用纯化的心肌细胞进行转录水平研究提供基础和依据。
方法：对8周雄性SD大鼠的心脏应用Langendorff灌流酶解法进行心肌细胞分离纯化,分离得到的细胞进行普通光学显微镜观察并细胞计数；吖啶橙染色后用荧光显微镜观察细胞形态；提取总RNA后应用分光光度计、琼脂糖凝胶电泳和测RNA完整指数(RNA integrity number, RIN)的方法检测RNA完整性；用Real-time RT-PCR的方法检测心肌组织中三种细胞特异性标志的相对表达量：肌钙蛋白T (TnT,心肌细胞)、波形蛋白(Vim,成纤维细胞)和平滑肌伐肌动蛋白(a-SMA平滑肌细胞),作为内参的看家基因分别为肽脯氨酰异构酶A(PPIA)和核糖体蛋白(RPLPO)。此外选用2周龄、3周龄和8周龄的雄性Wistar大鼠进行心肌细胞分离,分离后提取RNA,用Real-time RT-PCR的方法检测心肌组织中腺嘌呤核苷酸易位酶(ANT)的两种亚型ANT-1和ANT-2的表达量,内参基因选择PPIA。
结果：整个心肌分离过程大约需要30分钟左右,可以得到比较好的心肌产出率,普通光学显微镜下观察绝大部分细胞形态完整呈杆状,有明显的横纹,吖啶橙染色后在荧光显微镜下观察亦可见细胞形态完整,细胞核被染成明亮的绿色,而细胞外的背景几乎没有荧光产生。将形态典型的心肌细胞记为心肌细胞,其它均作为不典型细胞,3只大鼠的细胞计数结果n心肌细胞/n所有细胞分别为：87.3±3.2%,91.8±5.1%,88.1±3.3%。提取的总RNA的A260/280在1.8-2.0之间,符合Real-time RT-PCR需要的RNA纯度；电泳结果提示RNA没有明显的降解,与心肌组织提取的RNA无明显差异(n=3)；RIN值在7-8之间,亦适于进行Real-time RT-PCR,与心肌组织提取的RNA无明显差异(n=6,P0.05)。通过Real-time RT-PCR检测TnT、Vim和α-SMA相对于PPIA和RPLPO的表达量,均为经过分离Vim和α-SMA的表达量显著下降,而TnT的表达量显著上升(n=6,P0.05),三者的变化倍数分别为0.38、0.16、2.56(PPIA作为内参)和0.35、0.17、2.33(RPLPO作为内参)。ANT-1在心肌细胞中的表达量要远高于ANT-2(10±1.3倍,n=6),高的倍数比之前文献报道(以心肌组织作为样本)的结果要更显著,ANT-1和ANT-2在心肌发育过程中(2周、3周和12周)表达量的变化(n=6)也与之前文献报道(以心肌组织作为样本)有所差异。
1.通过对既往文献的总结,完善了Langendorff灌流酶解分离大鼠心肌细胞的方法,提纯度可达90%,细胞产量较高,适于提取RNA进行进一步研究；
2.该方法在分离过程中RNA没有明显的降解,适用于心肌基因表达分析；
3.基因表达分析的结果优于以心肌组织作为样本获取RNA,单纯以心肌组织为样本进行心肌细胞缺血再灌注损伤机制和心肌保护策略的研究是需要警惕的。
【关键词】：
【学位授予单位】：北京协和医学院【学位级别】：硕士【学位授予年份】：2011【分类号】：R329.2【目录】：
中文摘要4-6英文摘要6-81 引言8-92 材料方法9-20 2.1 实验动物9 2.2 主要实验试剂9-12 2.3 主要实验设备12-13 2.4 实验方法13-203 结果20-314 讨论31-365 结论36-376 参考文献37-41综述一41-46 参考文献43-46综述二46-63 参考文献53-63缩略词表63-65个人简历65-66致谢66
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原代心肌细胞培养方法探讨 原代心肌细胞培养技巧 新生大鼠心肌细胞的分离可采用组织块法和消化法，前者因不易获得密度均一的细胞且难控制成纤维细胞的生长而较少采用.消化法中常使用的酶有3种：胰蛋白酶、胶原酶I或Ⅱ以及透明质酸酶.透明质酸酶多与胰蛋白酶或胶原酶联合应用.胰蛋白酶作用较强，容易造成心肌细胞损坏.胶原酶作用较缓和，能消化细胞间质中的胶原纤维以释放细胞，对细胞损伤小，且在新生大鼠心肌组织 Nature：科学家证实哺乳动物心肌细胞的起源 心肌细胞日，哈佛干细胞研究所等处研究人员揭示了哺乳动物心肌细胞再生来源于预存心肌细胞，这篇题为“Mammalian heart renewal by pre-existing cardiomyocytes”文章在线发表在Nature杂志上。 Nature medicine：miR-499对于心肌细胞凋亡的影响 近日中科院动物研究所生物膜与膜生物工程国家重点实验室的研究人员在研究中检测了一种miRNA: miR-499对于条件诱导的心肌梗塞严重程度及心肌细胞凋亡的影响，并揭示了miR-499在心肌细胞中的调 肌细胞文档 新生大鼠心肌细胞
新生大鼠心肌细胞的分离可采用组织块法和消化法，前者因不易获得密度均一的细胞且难控制的生长而较少采用.消化法中常使用的酶有3种：、胶原酶I或Ⅱ以及透明质酸酶.透明质酸酶多与胰蛋白酶或胶原酶联合应用.胰蛋白酶作用较强，容易造成心肌细胞损坏.胶原酶作用较缓和，能消化细胞间质中的胶原纤维以释放细胞，对细胞损伤小，且在新生大鼠心肌组织
心肌细胞日，哈佛干细胞研究所等处研究人员揭示了哺乳动物心肌细胞再生来源于预存心肌细胞，这篇题为“Mammalian heart renewal by pre-existing cardiomyocytes”文章在线发表在上。
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