「不，不，她是我女儿，她是我女儿。」易伟狂怒的暴吼。
「对不起，林先生，她是我女儿。」獐头鼠目、油腔滑调的陈建名贼笑的开口道。
「我不相信敏芳会背叛我，晓晓是我的女儿。」易伟忆起敏芳温柔娴淑的模样，他
力求镇静。
「这个嘛──」陈建名小人般的低语，「一个月黑风高的夜晚，男主人因为出外景
而滞留国外，来『串门子』的我，欣赏嫂子闭月羞花的容貌，情不自禁的使她『蓝田种
玉』，你说，晓晓是不是我的女儿呢？」
易伟抓狂的冲向陈建名，紧掐着他的脖子，「卑鄙无耻的小人，你强暴敏芳。」
挣脱他，陈建名呛咳的说：「别说得那麽难听，我在你不在家时『照顾』她，完全
是看她难耐深闺，当然了，她挣扎哀求得满厉害的，不得已，我用刀子架在她美丽的颈
子上，请她配合，她可是很乖、很听话的。」
易伟语气森冷的开口问道：「你是不是还勒索敏芳？」
「哪有。」陈建名耸肩答道，「我只不过跟她借些钱花用而已。」
「是吗？」易伟丢出一叠纸张，喝道：「这些是什麽？」
拾起来一看，陈建名打哈哈，「别那麽生气啦！所谓『一夜夫妻百世恩』，这只不
过是我给『一夜』老婆的『甜言蜜语』罢了。」
「你无耻！不仅强暴敏芳，还勒索她，现在居然还要胁我，要我交出我女儿，告诉
你，我办不到。」易伟强烈的指控。
阴狠的陈建名讪笑的开口：「好一个办不到！林易伟，我只要向记者公开说明我女
儿的身世，无风不起浪，记者一查，你老婆被我强暴、勒索的事实一一浮上台面，到时
候你如日中天的明星生涯，不是就此中断了吗？」
奋不顾身的，易伟冲上去给陈建名一顿揍，为拍武侠片所练的跆拳道、柔道此时正
好派上用场，他想打死陈建名。
「易伟，够了，易伟，不要打了，你要考虑到晓晓呀！」王文德阻止他，怕他犯下
杀人罪。
「我要他死。」指着被***架开的陈建名，易伟激动的吼。
王文德了解他的悲恸，安抚他，「难道你要让他毁了你和晓晓的一生？让法律来制
裁他吧！」
「法律？」易伟狂笑，「文德，就是因为法律，使我失去找妹妹及妹夫，你还跟我
谈法律？」
「你妹妹？」陈建名饱尝一顿拳脚、遭***制伏後，第一次开口。
「对，他妹妹。」王文德气愤的开口，「你刚刚所说的话，都已经录音存证了。」
「他妹妹？」陈建名恐惧的咽口水，想确定般的追问。
「对，易伟的妹妹在她难产时，将一切事情发生的经过，告诉她丈夫和她哥哥；她
丈夫因她的死亡，忍受不了顿失亲人的伤痛，也跟着她而去，现在站在你面前的是她哥
哥，他找你复仇来了。」王文德咬牙切齿的说，「今天的一切，是易伟『请君入瓮』的
演出，你以为如何？」
「我┅┅我┅┅」陈建名讲不出话来，他知道这一次他死走了。「我的女儿┅┅」
「你没有女儿，晓晓是『我的』女儿，敏芳与我妹夫在过世前，都要求我照顾他们
的女儿，所以『我』才是晓晓的父亲。」易伟回过头来嘲讽道。
敏芳夫妇俩因为经常往来美、亚两洲经商，生怕有个三长两短，为了确保孩子的利
益，早在怀孕之初已将遗嘱拟好，所以，易伟是晓晓名正言顺的父亲。
「但她是我女儿呀！」陈建名着急的说，希望易伟看在他是晓晓的亲生父亲的份
上，放他一马。
「你不是，也不配。」易伟打断他的乞求，「敏芳当时不反抗你是怕伤了她肚子里
的孩子，不是因为怕死。」
「我┅┅」
「你什麽你。」王文德将陈建名带走，「早知如此，何必当初，偷窃事小，但强奸
、抢劫、勒索的後果，你自己看着办吧！」他不带同情心的对铐着手铐的陈建名说道。
易伟掩住耳朵，不想听见王文德告诫陈建名的话。
如果不是他出国，请妹妹、妹夫来度假帮忙看房子，这件事就不会发生，他妹妹与
妹夫也不会因鹣鲽情深而相继死亡，是他，他才是刽子手，他才是害死他们的凶手。
看着襁褓中的外甥女，易伟心中无限歉疚，他抱起晓晓，喃喃低语：「舅舅对不起
你，舅舅对不起你。」
窗外，春雷响起，像是配合易伟阴霾的心情，雨，倾盆般的猝然而下，沉睡中的晓
晓也惊醒的大声哭泣着。
今後，就只有他们两个人了，只剩他们「父女」俩相依为命了。
第一章
抬起头核对手中的住址是否和眼前的门牌一样，谢佩茵蹙起眉头望着眼前这栋雄伟
的建筑，老实说，她实在不想踏入这富裕之家，但生活的压力逼得她不得不低头。
再怎麽糟，也应该糟不过到酒店当服务生，更何况这个工作还是黄教授推荐的，应
该不会差到哪里去才是。
下定决心，她按了下门铃。
「谁？」低哑粗暴的声音由对讲机传来。
「对不起，这是林公绾吗？我是黄教授介绍来应徵保母的。」佩茵并不笨，屋内的
男子心情不太好，所以抬出教授当挡箭牌比较妥当。
「当！」的一声，门开了，佩茵耸耸肩，推开门走进去，心里直嘀咕，这家人也太
随便了，也不先确认一下来者的身分再开门。
但，佩茵已无暇再在这问题上打转了，眼前难得一见的美景已吸引住她全部的注意
力。诧紫嫣红的花朵盛开在由大门往主屋的碎石子路两旁，迎风飘曳的花儿煞是好看；
占地千馀坪的草坪修剪整齐，佩茵有股冲动想脱掉足下的束缚奔驰其间；鲤鱼池中，水
清澈见底，名贵品种的红龙优游其中，乌龟三五成群的嬉戏，这是富豪之家，一个她曾
驻足，而今不愿意再踏入的优渥之家。
「晓晓乖，晓晓不哭，舅舅抱，不要哭嘛！你不是吃饱了吗？尿布也没有湿呀！不
要哭嘛┅┅」
粗暴低哑的命令，换成哀求欲泣的低喃，阻止了佩茵往外走的步伐，她当下决定，
无论有没有获得这份工作，总可以牺牲些许的时间，来瞧瞧这画面──你爸哀求女儿，
这场戏绝不能错过。
「对不起，我是谢佩茵，文化大学夜间部┅┅」
「太好了。」昂藏七尺之躯的易伟松了口气，不管三七二十一，将手中的娃儿往佩
茵怀里塞，发出解脱的憔息。
倏地，惊天动地的哭闹声停止，易伟一脸惊诧，立刻说：「就是你了。」
抱好约莫六个月大的娃儿，佩茵逗弄着她，「小乖乖，太热了是不是？穿那麽多的
衣服热坏你了，让阿姨把你的外套脱掉如何？这样有没有舒服一点呢？我认为还是太多
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一见钟情等于见色起意？【9】
&&&&听着岑沐低微沙哑略显急促的声音，风洛颖心里痒痒的。
&&&&而那话的内容，她心里更加欢喜，忍不住弯起了唇角。
&&&&嗯，这样的男人，真是少见，不喜欢都难。
&&&&“好，我听你的……”清醒了些许，风洛颖往一边挪了挪，咬着唇低声说道。
&&&&岑沐嗯了一声，往门口挪去，怎奈身体所承受的折磨远比疲惫什么的都让人难以抗拒，只得停止挪动，对外面道：“外面的人，你们听着，不管你的目的是什么，都不该这样做！我们好好谈谈，你给我解药，你们提出什么条件我都答应，好吗？”
&&&&风洛颖听得一愣一愣的，顿了几秒才明白岑沐这是认为自个儿被人绑架威胁了，是要拍他不雅照达到什么目的。
&&&&既然如此，她就演一场好戏吧……
&&&&“啊啊！谁？谁？别拉我啊！啊啊！”假装被人拉走，风洛颖叫唤着，让自己程被拖走的姿势离开了卧室。
&&&&离开卧室，风洛颖去卫生间冲了凉水澡，把灯都给关了掉，开始做戏。
&&&&“岑沐，你听好了，我要你离开宁凌！”风洛颖用男声冲岑沐道，“你要是不答应，哼，这个女大学生，就送你享受享受！至于后果，自然也够你喝一壶的！”
&&&&一声话落，风洛颖立即用女声瑟缩的求饶：“不要，求你不要……呜呜……”
&&&&岑沐听着，头疼，犯难。
&&&&想了想，他说：“好，我答应。”
&&&&听到这四个字，风洛颖懵了，怎么能这么爽快呢？！
&&&&“呵！你当我是傻.子吗？答的这么干脆，想骗我，没门儿！”说完这些，风洛颖让自己以摔进去的姿势进了卧室，又一脚把卧室的房门给踢得关上，同时不忘尖叫哭泣。
&&&&而此时，她已经有些抵挡不住药力的催动了……
&&&&岑沐，你答的那么干脆，是不想伤害无辜女孩儿，还是不爱宁凌呢？
&&&&“咚，咚，咚……”岑沐挪到了门口，敲着门，无力的道：“哥们儿，我没骗你。我答的这么干脆，是因为我信基督，不能犯戒。我们，我们换个方式谈一谈，怎么样？”
&&&&许久没得到回答，岑沐一改之前态度，怒喝道：“你要是非要这么做，那咱们走着瞧！宁凌有多爱我，相信你知道，她是不会因为我被陷害就离开我的！”
&&&&一直在一旁假装低泣的风洛颖听得震惊的，不晓得怎么办了。
&&&&信基督，不能婚前性.行为……
&&&&这么说，他跟宁凌恋爱十年，连关系都没发生？
&&&&天，真服了他了！
&&&&哼，既然如此，对不住了亲！
&&&&今天不把你吃掉，我都对不起我自己！
&&&&“嗯……”忽然被搂住了腰，岑沐闷.哼一声，立即挣扎。
&&&&“姑娘，别这样……”压抑着几欲喷薄的冲动，岑沐咬牙，竭尽全力的掰着风洛颖的手指。
&&&&风洛颖贪恋这温暖的脊背，把脸颊贴上去，胸也贴上去，紧紧的贴上去，紧紧的抱住，才不要被拉开。
&&&&唔，听他叫她姑娘，感觉好好听。这个男人好奇怪，之前叫她小丫头，这会儿叫她姑娘，他是不是从来不叫别人“小.姐”呢？
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俄媒：军情六处曾用美人计引诱勃列日涅夫之子
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本版主要新闻细胞色素C在氟尿嘧啶诱导肝癌细胞凋亡中的作用
发布者: lmhlmh1000
文档分类: 工作计划
文档格式: PDF
纯文本预览：
第１６ 卷第１１ 期
２００７ 年１１ 月
中国普通外科杂志
Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｓｕｒｇｅｒｙ
Ｖｏｌ． １６ Ｎｏ． １１
Ｎｏｖ． ２００７
文章编号：１００５ －６９４７（２００７）１１ －１０８１ －０４
&基础研究&
细胞色素 Ｃ 在氟尿嘧啶诱导肝癌细胞凋亡中
（广西柳州市人民医院 外科， 广西 柳州 ５４５００１）
摘要：目的 检测细胞色素 Ｃ 在氟尿嘧啶诱导肝癌细胞凋亡过程中的作用， 分析细胞色素 Ｃ 在
线粒体和胞浆中的分布及其与 ｃａｓｐａｓｅ ?９ 活化的关系。 方法 用 １ & １０
ｍｏｌ ／ Ｌ 的 ５ ? ＦＵ 处理 ＨｅｐＧ２ 细
胞，分别作用 ２ ，４ ，８ ，１６ ，２４ ｈ，用荧光检测试剂盒检测 ＨｅｐＧ２ 细胞凋亡过程中细胞色素 Ｃ 分布变化；
Ｗｅｓｔｅｒｎ? ｂｌｏｔ 检测 ｃａｓｐａｓｅ ?９ 的活化和细胞色素 Ｃ 在胞浆及线粒体中的分布。 结果 氟尿嘧啶处理肝癌
细胞 ４ ｈ 后，ｃａｓｐａｓｅ ?９ 活性开始升高， 于 １６ ｈ 后达到高峰， 与对照组比较差异有显著性（ Ｐ ＜０． ０１ ） 。
Ｗｅｓｔｅｒｎ? ｂｌｏｔ 分析发现 ｃａｓｐａｓｅ ?９ 被蛋白酶水解切断后形成 １０ ｋＤ 片段；细胞色素 Ｃ 在胞浆中的分布从 ４
ｈ 后逐渐增加，１６ ｈ 最明显，而其在线粒体中的分布却正相反；细胞色素 Ｃ 的分布改变和 ｃａｓｐａｓｅ ?９ 的活
化基本同步。 结论 在氟尿嘧啶诱导肝癌细胞凋亡过程中 ｃａｓｐａｓｅ ?９ 被活化， 并伴有细胞色素 Ｃ 自线
粒体中释放到胞浆，提示细胞色素 Ｃ 可能在 Ｃａｓｐａｓｅ ?９ 的活化和肝癌细胞凋亡中起重要作用。
［ 中国普通外科杂志，２００７ ，１６ （ １１ ） ：１０８１ － １０８４ ］
关键词： 肝肿瘤／ 病理学； 氟尿嘧啶／ 治疗应用； 凋亡； Ｃａｓｐａｓｅ ?９ ； 细胞色素 Ｃ
中图分类号：Ｒ ７３５ ． ７ 文献标识码：Ａ
Ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｃ ｉｎ ｔｈｅ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｏｆ ｈｅｐａｔｏｍａ ｃｅｌｌ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ
ｆｌｕｒｏｕｒａｃｉｌ
ＹＡＮＧ Ｊｉａｎ?ｑｉｎｇ
（ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｓｕｒｇｅｒｙ， Ｐｅｏｐｌｅ ′ ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｏｆ Ｌｉｕｚｈｏｕ Ｃｉｔｙ， Ｌｉｕｚｈｏｕ， Ｇｕａｎｇｘｉ ５４５００１ ， Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｃ ｉｎ ｔｈｅ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｏｆ ｈｅｐａｔｏｍａ ｃｅｌｌ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ
ｆｌｕｒｏｕｒａｃｉｌ ， ａｎｄ ｔｏ ａｎａｌｙｚｅ ｔｈｅ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｃ ｉｎ ｃｙｔｏｓｏｌ ａｎｄ ｔｈｅ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ
ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｃ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃａｓｐａｓｅ?９ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ． Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｈｅｐａｔｏｍａ ＨｅｐＧ２ ｃｅｌｌｓ ｗｅｒｅ
ｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｆｌｕｒｏｕｒａｃｉｌ ａｔ １ & １０
ｍｏｌ ／ Ｌ ａｎｄ ２ ，４ ，８ ，１６ ，２４ ｈ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ． Ｔｈｅ ｃｈａｎｇ ｏｆ ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｃ ｉｎ
ＨｅｐＧ２ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｗａｓ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ ｕｓｉｎｇ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ ； ａｎｄ ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ ｃｌｅａｖａｇｅ ｏｆ ｃａｓｐａｓｅ?９ ａｎｄ
ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｃ ｉｎ ｃｙｔｏｓｏｌ ｏｒ ｉｎ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ ｗａｓ ａｎａｌｙｚｅｄ ｂｙ Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ ． Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｆｏｕｒ ｈｏｕｒｓ
ａｆｔｅｒ ｃｅｌｌｓ ｅｘｐｏｓｕｒｅ ｔｏ ｆｌｕｒｏｕｒａｃｉｌ ， ｔｈｅ ｃａｓｐａｓｅ?９ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ＨｅｐＧ２ ｃｅｌｌｓ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｇｒａｄｕａｌｌｙ ａｎｄ ｒｅａｃｈｅｄ ｔｈｅ
ｐｅａｋ ａｔ １６ ｈ， ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐｓ ， ｔｈｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ｗａｓ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ （ Ｐ ＜ ０ ． ０１ ） ． Ｉｎ Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ
ａｎａｌｙｓｉｓ ， ｃａｓｐａｓｅ?９ ｗａｓ ｆｏｕｎｄ ｔｏ ｂｅ ｃｌｅａｖｅｄ ｉｎｔｏ １０ ｋＤ ｆｒａｇｍｅｎｔ ， ａｎｄ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｃ ｉｎ ｃｙｔｏｓｏｌ
ｂｅｃａｍｅ ｍｏｒｅ ａｎｄ ｍｏｒｅ ｏｂｖｉｏｕｓ ｆｒｏｍ ４ ｈ ｏｎ ａｎｄ ｒｅａｃｈｅｄ ａ ｐｅａｋ ａｔ １６ ｈ，ｂｕｔ ｔｈｅ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｃ
ｉｎ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ ｗａｓ ｏｐｐｏｓｉｔｅ． Ｔｈｅ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｃｈａｎｇｅ ｏｆ ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｃ ａｎｄ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃａｓｐａｓｅ?９
ｗｅｒｅ ｓｙｎｃｈｒｏｎｏｕｓ ． Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎｓ Ｃａｓｐａｓｅ?９ ｗａｓ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｏｆ ＨｅｐＧ２ ｃｅｌｌｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ
ｆｌｕｒｏｕｒａｃｉｌ ， ａｃｃｏｍｐａｎｉｅｄ ｂｙ ｒｅｌｅａｓｅ ｏｆ ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｃ ｆｒｏｍ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ ｔｏ ｃｙｔｏｓｏｌ ． Ｔｈｉｓ ｄａｔａ ｉｍｐｌｉｅｓ ｔｈａｔ
ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｃ ｐｌａｙｓ ａｎ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｒｏｌｅ ｉｎ ｔｈｅ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃａｓｐａｓｅ?９ ａｎｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｏｆ ｈｅｐａｔｏｍａ ｃｅｌｌ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ
ｆｌｕｒｏｕｒａｃｉｌ ． ［ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｓｕｒｇｅｒｙ，２００７ ，１６ （ １１ ） ：１０８１ － １０８４ ］
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ ： Ｌｉｖｅｒ Ｎｅｏｐｌａｓｍｓ ／ ｐａｔｈｏｌ ； Ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ ／ ｔｈｅｒ ｕｓｅ；Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ； Ｃａｓｐａｓｅ?９ ； Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｃ
ＣＬＣ ｎｕｍｂｅｒ： Ｒ ７３５ ． ７ Ｄｏｃｕｍｅｎｔ ｃｏｄｅ： Ａ
收稿日期：２００７ －０９ －１４； 修订日期：２００７ －１０ －２９。
作者简介：杨建青，男，江西人，广西医科大学第五附属医院、柳州市人民医院副主任医师，主要从事肝癌基因治疗、
肝移植方面的研究。
通讯作者：杨建青 Ｅ?ｍａｉｌ：ｈａｗｋ１２１８＠ ｓｉｎａ． ｃｏｍ
中国普通外科杂志 第１６ 卷
研究发现化疗药物主要是通过损伤肿瘤细胞
启动其内在的死亡程序即凋亡， 并非导致死亡。
凋亡是细胞发生不可修复损伤后按指令自我执行
的一种主动的、程序性死亡方式，受细胞内外信号
转导调控。 迄今发现细胞凋亡主要经过两条死亡
，一条是外源性通路，即由死亡受体及配体
系统激发的凋亡信号下传至启动性 ｃａｓｐａｓｅ?８ ， 然
后激活效应性 ｃａｓｐａｓｅ 蛋白酶而引发细胞凋亡； 另
一通路称为内源性通路， 细胞损伤后线粒体功能
障碍，膜通透性改变， 凋亡蛋白包括细胞色素 Ｃ
（ ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｃ， ｃｙｔｏ Ｃ） ，Ａｐａｆ ?１ 及 Ｓｍａｃ ／ ＤＩＡＢＬＯ 等
从线粒体释放到胞浆， ｃａｓｐａｓｅ?９ 与之形成凋亡体
（ ａｐｏｐｏｓｏｍｅ） 并被激活， 随之引起 ｃａｓｐａｓｅ 瀑布式活
化和细胞死亡
［２ －３］
［４ －６］
在以往研究中已证
实氟尿嘧啶可诱导肝癌细胞凋亡， 并有凋亡相关
基因参与调控， 但内源性通路对诱导肝癌细胞凋
亡的作用尚不明确。 本研究旨在了解氟尿嘧啶是
否亦经内源性通路诱导肝癌细胞凋亡， 以进一步
阐明化疗的确切分子机制， 为寻找新的药物治疗
肿瘤靶点提供实验和理论依据。
１ 材料与方法
１ ． １ 材料
人肝癌 ＨｅｐＧ２ 细胞株（ 中南大学细胞中心提
供） ，氟尿嘧啶（ 上海旭东海普药业有限公司） 产
品，兔抗 ｃａｓｐａｓｅ?９ 、 细胞色素 Ｃ 抗体和 ＨＰＲ 标记
的羊抗兔抗体（ Ｂｏｓｔｅｒ 公司） ， 核糖核酸酶 Ａ、 碘化
丙锭（ Ｓｉｇｍａ 公司） ， 细胞色素 Ｃ 荧光检测试剂盒
（ Ｃｌｏｎｔｅｃｈ 公 司） ， ｃａｓｐａｓｅ?９ 抑制 剂 Ｚ? ＬＥＨＤ? ＦＭＫ
（ Ｒ ? Ｄ， ＵＳＡ） ， ＤＭＥＭ 培养基（ ＧＩＢＣＯ 公司） ， 荧
光分光光度计（ ＨＩＴＡＣＨ 公司） ， ＦＡＣＳ Ｓｔａｒ 流式细
胞仪（ 美国） 。
１ ． ２ 实验方法
１ ． ２ ． １ 细胞培养及处理 ＨｅｐＧ２ 用含 １５ ％ 小牛
血清 的 ＤＭＥＭ 培 基 培 养。 并 在 培 基 中 加 入
２ ｍｍｏｌ ／ Ｌ 谷 氨 酰 胺， １００ ｋＵ ／ Ｌ?１ 链 霉 素 和 蔼
１００ ｋＵ ／ Ｌ 青霉素，细胞培养条件３７ ℃，５０ ｍＬ ／ Ｌ 二
氧化碳浓度。 待细胞进入对数生长期后加入
ｍｏｌ ／ Ｌ氟尿嘧啶，分别作用 ２ ，４ ，８ ，１６ ，２４ ｈ，
每组标本数为 ６ 。
１ ． ２ ． ２ 细胞线粒体及胞浆的分离 收集 １０６ 细
胞，加入含 ２５０ ℃ ｍＭ 蔗糖的细胞裂解液， 用匀浆
器进一步裂解细胞， 匀浆液于 ４ ℃ 下 ７５０ ｇ 离心
１０ ｍｉｎ， 取上清，再在４ ℃下１０ ０００ ℃ｇ 离心１５ ｍｉｎ，
所得沉淀部分即为线粒体； 上清继续于 ４ ℃ 下
１０ ０００ ｇ 离心１ ｈ，所得上清即为胞浆。 所有操作均
在冰上进行。
１ ． ２ ． ３ Ｃａｓｐａｓｅ?９ 活性检测 按试剂盒说明进
行：收集 １０６ 细胞，每份样本加入 ５０ μＬ 细胞裂解
液，冰上孵育 １０ ｍｉｎ，离心（ １０ ０００ ｇ，４ ℃，５ ｍｉｎ ） ，
取上清（ 其中 ５ μＬ 用 Ｂｒａｄｆｏｒｄ 法作蛋白定量， 读取
５９５ ｎｍ 吸 光 值） ， 再 加 入 ５０ μＬ 反 应 缓 冲 液 和
５ μＬＣａｓｐａｓｅ 底物 ＬＥＨＤ? ｐＮＡ（ 亮氨酸 － 谷氨酸 － 组
氨酸 － 天冬氨酸? ｐ? 硝基苯胺） ，３７ ℃ 孵育 １ ． ５ ｈ，
读取 ４０５ ｎｍ 吸光值。 Ｃａｓｐａｓｅ 活性 ＝ ＯＤ４０５ ｎｍ ／
ＯＤ５９５ ｎｍ。
１ ． ２ ． ４ Ｗｅｓｔｅｒｎ? ｂｌｏｔ 检测 Ｃａｓｐａｓｅ?９ 活化 细胞先
经冷 ＰＢＳ 冲洗 ３ 遍， 用加样缓冲液裂解细胞，
１００ ℃ 水 浴 １０ ｍｉｎ 后， 离 心 （ １０ ０００ ｒ ／ ｍｉｎ &
１０ ｍｉｎ） ，收集上清，采用考马斯亮蓝法进行蛋白定
量，制备好的蛋白样品置 － ８０ ℃ 冰箱保存备用。
以 ２０μｇ 蛋白／ 泳道上样， 经 １２ ％ 聚丙烯酰胺凝胶
ＳＤＳ? ＰＡＧＥ 电泳后， 电转膜至硝酸纤维膜。 室温封
闭 ３ ｈ，加兔抗 ｃａｓｐａｓｅ?９ 抗体，室温下孵育 ２ ｈ，再加
ＨＲＰ 标记的羊抗兔抗体，室温下孵育 １ ｈ，采用 ＤＡＢ
显色试剂盒进行显色约 ２ ～ ５ ｍｉｎ，待蛋白条带显色
清晰时，终止反应，拍摄照片，记录实验结果。
１ ． ２ ． ５ Ｗｅｓｔｅｒｎ? ｂｌｏｔ 检测细胞色素 Ｃ 的释放 细
胞先经冷 ＰＢＳ 冲洗 ３ 遍，用加样缓冲液裂解细胞，
１００ ℃ 水 浴 １０ ｍｉｎ 后， 离 心 （ １０ ０００ ｒ ／ ｍｉｎ &
１０ ｍｉｎ） ，收集上清，采用考马斯亮蓝法进行蛋白定
量，制备好的蛋白样品置 － ８０ ℃ 冰箱保存备用。
以 ２０ μｇ 蛋白／ 泳道上样，经 １２ ％ 聚丙烯酰胺凝胶
ＳＤＳ? ＰＡＧＥ 电泳后，电转膜至硝酸纤维膜。 室温封
闭 ３ ｈ，加兔抗细胞色素 Ｃ 或 Ｓｍａｃ ／ ＤＩＡＢＬＯ 抗体，
室温下孵育 ２ ｈ， 再加 ＨＲＰ 标记的羊抗兔抗体， 室
温下孵育 １ ｈ， 采用 ＤＡＢ 显色试剂盒进行显色约
２ ～５ ｍｉｎ，待蛋白条带显色清晰时， 终止反应， 拍摄
照片，记录实验结果。
１ ． ２ ． ６ 间接免疫荧光细胞化学技术检测细胞色素
Ｃ 在细胞内的分布 细胞接种在放置玻片的平皿
中，待细胞贴在玻片上生长后加药处理，分别在 ２，４
ｈ 和８ ｈ 后用 ４ ％ 多聚甲醛固定细胞，０． １ ％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ
－ １００ 在细胞膜上打孔， 加入兔抗细胞色素 Ｃ 或
Ｓｍａｃ ／ ＤＩＡＢＬＯ 的抗体孵育３ ｈ ，生物素标记的羊抗兔
二抗孵育１ ｈ，Ｃｙ３（ 红色荧光） 标记的链亲和素孵育
０． ５ ｈ，水溶性封片剂封片后在荧光显微镜４９５ｎＭ 波
长下观察细胞色素 Ｃ 在细胞内的分布。
２ ８ ０ １
第１１ 期 杨建青：细胞色素Ｃ 在氟尿嘧啶诱导肝癌细胞凋亡中的作用
１ ． ２ ． ７ 细胞凋亡百分率的检测 离心收集 １０６
细胞， 用 ７０ ％ 乙醇固定， 细胞核 ＤＮＡ 荧光素（ 碘
化丙锭） ４ ℃避光染色 ３０ ｍｉｎ，用流式细胞仪分析。
测定前以鸡血红细胞作为标准品调整仪器的 ＣＶ
值在 ３ ％ 以内， 测 量 数 据和图形送入 ＨＰ? Ｃｏｎ?
ｓｏｒｔ３００ 计算机，应用相应的程序软件进行资料处
理，计算出细胞凋亡百分率。
１ ． ３ 统计学方法
所有 数 据 均 用 ｘ & ｓ 表 示， 组 间 比 较 采 用
Ｓｔｕｄｅｎｔ ′ ｔ 检验，Ｐ ＜ ０ ． ０５ 时认为差异有显著性，使
用 ＳＰＳＳ１０ ． ０ 统计软件进行数据处理。
２ 结 果
２ ． １ ｃａｓｐａｓｅ?９ 活性变化
氟尿嘧啶处理肝癌细胞 ４ ｈ 后， ｃａｓｐａｓｅ?９ 活性
开始升高，细胞凋亡增加，并随着时间延长而越明
显，至 １６ ｈ 达到峰值， 但直至 ２４ ｈ 仍显著高于对
照组（ Ｐ ＜ ０ ． ０５ ～ Ｐ ＜ ０ ． ０１ ） （ 表 １ － ２ ） 。
表１ 氟尿嘧啶诱导肝癌细胞凋亡过程中ｃａｓｐａｓｅ?９ 的活性变化（ｘ & ｓ）（ｎ ＝６）
组别 ２ ｈ ４ ｈ ８ ｈ １６ ｈ ２４ ｈ
空白对照组 １２６． ４ &５． ４ １３１． ２ &５． ７ １２８． ５ &３． ６ １３０． ６ &５． ２ １３３． ５ &３． ８
实验组 １５８． ５ &５． ６ ２６５． ３ &５． ９
３４２． ８ &６． ５
４３６． ７ &７． ５
３１３． ９ &６． ９
注：与空白对照组比较，１）Ｐ ＜０． ０５；２）Ｐ ＜０． ０１
表２ 氟尿嘧啶诱导的肝癌细胞凋亡（ｘ & ｓ）（ｎ ＝６）
组别 ２ ｈ ４ ｈ ８ ｈ １６ ｈ ２４ ｈ
空白对照组 ４． ５５ &０． ５４ ４． ６２ &０． ２１ ４． ５６ &０． ７２ ４． ９６ &０． ８５ ４． ４６ &０． ７３
实验组 ８． ３４ &０． ５３ ９． ９１ &０． ５９
１１． １５ &０． ９１
１５． ６８ &１． ００
１３． ５２ &０． ８６
注：与空白对照组比较，１）Ｐ ＜０． ０５； ２）Ｐ ＜０． ０１
２． ２ Ｗｅｓｔｅｒｎ?ｂｌｏｔ
经 Ｗｅｓｔｅｒｎ? ｂｌｏｔ 分析发现， 在氟尿嘧啶诱导肝
癌细胞凋亡过程中， ｐｒｏ? ｃａｓｐａｓｅ?９ 被蛋白酶水解
切断，形成了 １０ ｋＤ 片段， 药物作用 ４ ｈ 后开始出
现，１６ ｈ 最明显（ 图 １ ） 。 同时也见细胞色素 Ｃ ４ ｈ
后在胞浆中有分布， 并有时间依赖性，１６ ｈ 最明
显（ 图 ２ ） 。 ｐｒｏ? ｃａｓｐａｓｅ?９ 的活化与细胞色素 Ｃ 的
释放基本同步。
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20 ./0 620
图１ ｐｒｏ?ｃａｓｐａｓｅ?９ 被蛋白酶水解切断，形成了１０ｋＤ 片段 图２ 细胞色素在线粒体和胞浆中的分布，每组右侧条带为
线粒体，左侧为胞浆
２ ． ３ 间接免疫荧光细胞化学技术检测细胞色素
Ｃ 在细胞内的分布
间接免疫荧光法检查发现， 未受药物处理的
肝癌细胞中细胞色素 Ｃ 蛋白荧光的分布呈粗点
状或细块状，提示细胞色素 Ｃ 蛋白局限于线粒体
（ 图３ ） 。 药物处理细胞２ ｈ 后，线粒体细胞色素 Ｃ
蛋白荧光呈弥散细点状， 均匀分布于胞浆， 表示
蛋白从线粒体释放到胞浆（ 图 ４ ） 。
３ ８ ０ １
中国普通外科杂志 第１６ 卷
图３ 细胞色素Ｃ 蛋白分布呈粗点状或细块状（箭头所指）（ &４００） 图４ 细胞色素Ｃ 蛋白呈弥散性点状分布（箭头所指）（ &４００）
３ 讨 论
内源性凋亡通路在细胞损伤所激发的细胞凋
亡中的地位日益受到重视， “ 内部应急” 如癌蛋
白、直接 ＤＮＡ 损伤、 缺氧和存活因子撤除能激活
内源性通路
。 一系列致凋亡蛋白包括细胞色素
Ｃ （ ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｃ， ｃｙｔｏ Ｃ ） 、 ＡＩＦ （ Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎｄｕｃｉｎｇ
ｆａｃｔｏｒ ） 及 Ｓｍａｃ ／ ＤＩＡＢＬＯ 等从线粒体转移到胞浆引
发 ｃａｓｐａｓｅ 瀑布式活化，启动凋亡
［８ －９］
细胞色素 Ｃ 由核基因编码， 先在胞浆中合成
不含血红素的孤细胞色素 Ｃ （ Ａｐｏｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｃ ） ，
然后移入线粒体中， 并与血红素基团结合形成全
细胞色素 Ｃ（ Ｈｏｌｏｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｃ） 。 全细胞色素 Ｃ 为
可溶性蛋白， 正常时位于线粒体膜间腔， 为呼吸
链电子转运体。 全细胞色素 Ｃ 释放到胞浆后， 在
有 ｄＡＴＰ ／ ＡＴＰ 存在时， 可与凋亡活化因子 Ａｐａｆ ?１
（ Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ ） 组合成轮状凋亡体（ Ａｐ?
ｏｔｏｓｏｍｅ） 。 １ 个凋亡体和 ７ 个 ｃａｓｐａｓｅ?９ 前体借助
相互间的 ＣＡＲＤ 结构域而结合，由于局部高浓度，
使 ｃａｓｐａｓｅ?９ 前体发生自身蛋白酶水解裂解而活
。 细胞未发生凋亡时， 由于线粒体外膜完
整，细胞色素 Ｃ 被禁闭于线粒体当中， 荧光相对
集中于线粒体中， 因而呈点状或细块状。 细胞一
旦凋亡，线粒体功能就开始出现功能紊乱， 细胞
色素 Ｃ 释放到胞浆， 就会造成荧光呈弥散状分
。 本实验研究证实，氟尿嘧啶诱导肝癌细胞
凋亡过程中，在凋亡早期就有细胞色素 Ｃ 从线粒
体释放到胞浆。 间接免疫荧光法检查发现仅药
物处理 ２ ｈ 后代表细胞色素 Ｃ 的荧光在细胞中的
分布即发生明显变化， 由点状或细块状分布变弥
散状分布。 本研究的 Ｗｅｓｔｅｒｎ? ｂｌｏｔ 的结果也支持
上述结果，药物处理 ４ ｈ 后可见线粒体中的细胞
色素 Ｃ 量也开始减少， 而胞浆中的量开始增多。
而且这种动态变化方式与药物诱导凋亡的过程
在时间上基本同步。 提示， 在氟尿嘧啶诱导肝癌
细胞凋亡的早期就发生了线粒体功能紊乱， 有细
胞色素 Ｃ 从线粒体释放到胞浆。
Ｃａｓｐａｓｅ?９ 是内源性凋亡通路的最上游蛋白
酶，处在 ｃａｓｐａｓｅ 瀑布式活化的尖端。 因此， 它的
活化对于整个内源性凋亡通路的激活尤为重要。
ｃａｓｐａｓｅ?９ 与其它 ｃａｓｐａｓｅ 家族成员很相似， 以无活
性的酶原形式存在于胞浆中。 ｃａｓｐａｓｅ?９ 作为细胞
凋亡内源性通路的启动性 ｃａｓｐａｓｅ ，其活化需与细
胞色素 Ｃ 和 Ａｐａｆ ?１ 形成的凋亡体结合，通过蛋白
酶水解裂解成大（ ３５ ｋＤ） 、 小（ １０ ｋＤ） 亚单位， 才
能产 生 有 催 化 活 性 的 异 源 四 聚 体， 即 成 熟 的
ｃａｓｐａｓｅ?９
［９ －１０］
， 才可以催化效应性 ｃａｓｐａｓｅ?３ 或?６
的蛋白酶水解裂解， 引发 ｃａｓｐａｓｅ 瀑布式活化， 导
致细胞迅速瓦解死亡。 本实验发现，Ｐｒｏ? ｃａｓｐａｓｅ?９
的活化与细胞色素 Ｃ 从线粒体释放到胞浆基本
同步，提示细胞色素 Ｃ 可能在 ｃａｓｐａｓｅ?９ 的活化和
肝癌细胞凋亡中可能有着重要作用。
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［ １１ ］ Ｍｏｓｓｅｒ ＤＤ， Ｃａｒｏｎ ＡＷ， Ｂｏｕｒｇｅｔ Ｌ， ｅｔ ａｌ ． Ｔｈｅ ｃｈａｐｅｒｏｎｅ
ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｓｐ７０ ｉｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ａｇａｉｎｓｔ ｓｔｒｅｓｓ ? ｉｎ?
ｄｕｃｅｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ［ Ｊ ］ ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ， ２０００ ，
２０ （ １９ ） ：７１４６ － ７１５９ ．
４ ８ ０ １
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