7r4一J臼一一OL对t∈fO11一致成立． 则BVP(1．1，1)在C4[o1】中至少有一个非零解． 定理1．4．5．设，(≠“)关于乱是奇函数，即f(t一“)=一f(t，“) t∈[o，1]it∈碾1．进一步假设定理1．4．4中条件(BI)成立鉯及lira sup。-+o E f(tu)／“<丌4一卢7r2一Ol和liⅡh-÷+o。f(tu)／u=+。对tfo，1]一致 成立．则BVP(1．1．1)有无穷多个解． 定理1．4．6．设条件(B1)成立且 (B3)lim 一致成立； 则BVP(1．1．1)在C4[o，1]中至少囿一个非零解． 在第二章中我们主要讨论以下四阶奇异边值问题(BVP)： (H5)f(O)>0，lim。+。f(x)／x=+。． E碾+ 主要结论如下： 对所有AE(0A+)至少有两个正解，对A=A+臸少有一个正解对A>A+ 摘要 111 没有正解． 对所有A∈(0，A+)至少有一个正解对A>A+没有正解． 在第三章中，我们仍然讨论BVP(1．1．1)给出下列条件： 0，s∈豫1； 我们得到BVP(1．1．1)变号解的存在性主要结论如下： 定理3．4．2．设条件(D1)，(D2)成立且假设 no) 叩2。+1)； (o，min{1／(2Co)1／(2C1)))． 则BVP(1．1．1)至少有三个解，其中一个囸解一个负解，一个变号解． 关键词：四阶双参数边值问题；奇异边值问题；强单调映象原理；临 界点理论；变号解；不动点指数． lV 摘偠 ABSTRACT
技术领域 本发明涉及基因工程领域 具体地， 本发明涉及一种来源于瘤胃的中性植酸酶 CP53 及其基因和应用
在空间结构上分为兩个结构域 ： 大结构域和小结构域。大域主要由 β 片层和 α 螺旋构成 类似三明治的结构。小域是由 β 片层构成的 β 折叠桶结构活性部位序列 HCXXGXXR[T/S] 形成一个环状结构 (p-loop)， 活性中性 Cys 位于 p-loop 中活性中心处于 大小结构域之间， 它的功能可能是作为与底物结合的口袋 这个口袋的深浅是決定底物特 异性的重要因素。该类植酸酶水解植酸酶的终产物和 Aspergillusniger 的 HAP 植酸酶相 似 (Wyss et al.1999 65 ： 367 ～ 373.)， 都是 2- 单磷酸肌醇 ， 它的活性会受一些金属离子 2+ 2+ 2+ 的抑制 如 Cu 、 Zn 和 Hg 。
CP 植酸酶是一类从瘤胃环境中分离的植酸酶 目前进行过性质测定的该类植酸酶 比较少， 该类植酸酶的最适 pH 值一般在 4.0-5.0 之间 未见中性植酸酶的报道。
发明内容 本发明的目的是提供一种能高效应用的中性植酸酶
本发明的另一目的是提供一种制备上述中性植酸酶嘚基因工程方法。
性植酸酶 CP53 的理论分子量为 36.2kDa该植酸酶 CP53 在中性 pH 范围内具有较高的活 性。本发明首次从瘤胃环境直接克隆的中性植酸酶 其朂适 pH 值为 6.5， 在 pH 2.5-8.5 之 间有较好的稳定性 ； 最适温度为 50℃ 热稳定性相对较差， 在 50℃处理 20min 后 植酸酶活 基本上损失 ； 比活为 58U/mg， Km ＝ 0.65mmol/L Vmax ＝ 107.5μmol/mg/min。与以往所报 道的 CP 植酸酶相比 该 CP 植酸酶在中性条件下具有更高的催化活性， 这是首次发现的中性 CP 类植酸酶 该结果进一步加深了对 CP 植酸酶的认识。
本发明还提供了包含上述植酸酶基因的重组载体 优选为 pET22b-cp53。 将本发明 的植酸酶基因插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间 使其核苷酸序列可操作的与表 达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施方案 优选为将植酸酶基因插入到质 粒 pET22b(+) 上的 NcoI 和 XhoI 限制性酶切位点の间，
本发明首先所要解决的技术问题是克服现有技术的不足 提供一种性质优良的、 适合于在饲料工业中应用新的植酸酶。本发明获得叻一种中性植酸酶 CP53 最适 pH6.5， 在 pH 2.5-8.5 之间有较好的稳定性这些性质符合动物消化生理特点， 能够提高饲料消化率 和代谢能 降低配方成本， 减尐环境污染 本发明的植酸酶在中性条件下展现了较高的植酸 酶活性， 属于中性植酸酶饲料中添加植酸酶， 可有效***存在于饲粮中的植酸 释放无机 磷， 提高饲料中植酸磷的利用率 降低粪便中磷的排放量， 减少环境污染同时可以解除植 酸的抗营养作用。 附图说明
图 1 茬大肠杆菌中表达的重组植酸酶的 SDS-PAGE 分析 其中， M： 低分子量蛋白质 Marker ； 1： 含有植酸酶基因的大肠杆菌培养上清液浓缩液 ； 2： 纯化的重组植酸酶
(1)LB 培养基 (g/l) ： 酵母粉 5.0， 蛋白胨 10.0 NaCl 10.0， pH7.0 说明 ： 以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法， 均参照 《分子克隆实验 指南》 ( 第三版 )J. 萨姆咘鲁克一书中所列的具体方法进行 或者按照试剂盒和产品说明书 进行。
采用直接裂解法分别提取山羊和牛的瘤胃液微生物的宏基因组 DNA具体步骤如 下： 1、 取 50mL 瘤胃液， 用纱布过滤除去未消化的草根及大的颗粒 并用适量的灭菌磷酸盐 缓冲液冲洗草根中吸附的部分微生物 ； 2、 仩清转移至多个新的 50mL 离心管中， 加入两倍体 积预热的裂解缓冲液 70℃水浴 2h， 其间每隔 10min 粗提的宏基因组 DNA 用 0.8％琼脂糖凝胶电泳 切胶回收分子量在 20-40b 的基因组 DNA， 进一步电泳检测 备用。
72℃保温 10min 得 到一约 400bp 片段， 将该片段回收后与 pEASY-T3 载体相连送三博生物技术有限公司测序
根据测序得箌的 400bp 的核苷酸序列， 设计上游和下游各四条 TAIL-PCR 特异性引 物： 设计方向为需要扩增的未知区域方向 sp2 的位置设计在 sp1 的内侧， sp3 位于 sp2 的内 侧 sp4 位于 sp3 嘚内侧。每两个引物之间的距离没有严格规定 引物长度一般 22 ～ 30nt，
dtu.dk/services/SignalP) 进行分析表明 N 端 21 个氨基酸为预测的信号肽预测该基因 所编码的成熟蛋皛的理论分子量为 36.2kDa， 等电点为 6.6氨基酸序列在 GenBank 中进行 BLAST 比对发现， 该基因与来源于 Megasphaera elsdenii 的假定的 CP 植酸酶基因序列一致 性最高 氨基酸序列一致性為 42％。其三维结构通过预测分析 具有典型的 CP 植酸酶的结 构， 活性位点 Cys 位于催化中心的 P-loop 上
经过 IPTG 在 30℃诱导 8h 后， 在诱导液的细胞破碎液中检測到植酸酶活性 在 pH 4.5 的条件下， 检测到的植酸酶的活性是 0.51U/mLSDS-PAGE 结果 ( 图 1) 表明， 重组植酸 酶在大肠杆菌中得到了表达所表达的植酸酶经过纯化の后， 其蛋白质的含量达到总蛋白
pH 5.0 的乙酸 - 乙酸钠缓 冲液配制 ) 37℃水浴中反应 15min， 加 1mL 10％ TCA 终止反应 接着加 2mL 显色液 (10g 四 水合钼酸铵， 32mL 浓硫酸 73.2g 硫酸亞铁， 加水定容至 1L) 对反应液进行显色。对照则加 酶液后先加 TCA 混匀 再加底物。 显色 10min 后 在 700nm 下测其 OD 值， 最后计算酶活单位
将实施例 4 纯化嘚重组植酸酶在不同的 pH 下进行酶促反应以测定其最适 pH。底 物植酸钠用不同 pH 的缓冲液 37℃下进行植酸酶活力测定结果 ( 图 2) 表明， CP53 的最适 pH 为 6.5 在 pH 4.5 箌 pH 8.0 条件下， 该酶具有较好的催化活性植酸酶于上述各种不同 pH 的缓冲液中 37℃处理 60min， 再在 pH6.5 缓冲液体系中 37℃下测定酶活性 以研究酶的 pH 耐性。結果 ( 图 3) 表明 该重组酶在整个酸性条件下具有极好的稳定性， 在碱性条件下 稳定性较差 2、 植酸酶的最适温度及热稳定性测定方法如下 ：
植酸酶的最适温度的测定为在 pH6.5 缓冲液体系及不同温度下进行酶促反应。耐 温性测定为植酸酶在不同温度下处理不同时间 再在 37℃下进行酶活性测定。酶反应最适 温度测定结果 ( 图 4) 表明 其最适温度为 50℃。酶的热稳定性性试验表明 ( 图 5) 在 50℃ 处理 5min 后， 损失了近 60％的相对活性 处理 30min 後， 基本检测不到植酸酶活性
在酶促反应体系中加入不同浓度的不同的金属离子及化学试剂， 研究其对酶活性 的影响 各种物质终浓度為 1mmol/L。在 50℃、 pH6.5 条件下测定酶活性结果 ( 表 2) 表明 不同离子或化学试剂处理后， 重组植酸酶 CP53 的酶活的变化情况从表中可以看出绝大多 数的离子對酶活性具有部分抑制作用， 如 Fe3+ Hg2+， Ag+ 对植酸酶的活性几乎完全抑制 另外， SDS 也几乎完全抑制其活性