荧光指示标签怎么用
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徐飞, 周洁, 吴超, 王建芬, 丁双阳, 李秀波. 一种基于荧光微球标记的卡那霉素免疫层析定量方法的建立. ): XU Fei, ZHOU Jie, WU Chao, WANG Jian-fen, DING Shuang-yang, LI Xiu-bo. Development of a Microsphere-Based Fluorescence Immunochromatographic Assay for Detection of Kanamycin. Scientia Acricultura Sinica, ): &&
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一种基于荧光微球标记的卡那霉素免疫层析定量方法的建立
1中国农业科学院饲料研究所/国家饲料药物基准实验室,北京 100081
2中国农业大学动物医学院/国家兽药残留基准实验室,北京 100193
3北京市延庆县畜牧技术推广站,北京 102100
联系方式：徐飞,Tel：010-;E-mail：。通信作者：丁双阳,E-mail：;通信作者：李秀波,E-mail：
基金:农业部公益性行业（农业）科研专项经费项目（）、奶牛产业技术体系北京市创新团队项目
【目的】 卡那霉素是一种在奶牛兽医临床常用药物,其在牛奶中的残留不容忽视。荧光微球作为一种新型的荧光示踪物,近年来在小分子快速检测方面呈现出独特的优势,试验开展了卡那霉素荧光微球免疫层析定量方法的研究,旨在为牛奶中卡那霉素药物的快速筛选提供新型有效的检测手段。【方法】 采用戊二醛法和过碘酸钠法制备了两种卡那霉素的包被抗原（KANA-GA-OVA1、KANA-I2-OVA2）,抗卡那霉素的单克隆抗体通过蛋白G免疫亲和柱进行纯化后,采用碳二亚胺法与荧光微球进行了共价偶联,成功制备了抗体-荧光微球标记物。免疫层析试纸条方法采用微孔测定法。包被卡那霉素包被抗原的NC膜作为固相载体,荧光微球标记的单克隆抗体与样品混合,在微孔膜的毛细管作用下,包被抗原和待测样本中的药物来共同竞争有限的单克隆抗体,通过荧光测定包被抗原结合的抗体量来评价待测样本中卡那霉素药物的含量。【结果】 灵敏度试验表明,微孔中加入0、6.25、12.5、25、50、100、200 µg·L-17个浓度梯度的标准品溶液,卡那霉素药物浓度的增加,试纸条T线的荧光强度逐渐减弱,呈现抑制状态,以无标准品抑制的荧光峰高值为F0值,相应浓度标准品抑制时的荧光峰高值为F值,以F/F0为纵坐标,以标准品浓度为横坐标,绘制标准曲线。利用Originpro 8.0 软件拟合,曲线符合四参数方程, R2为0.9998,IC50值为24.8 µg·L-1,线性范围（以20%—80%抑制率对应的浓度计算）为9.5&#x µg·L-1,最低检出限（以10%抑制率对应的浓度计算）为5 µg·L-1。准确度和精密度试验表明,以25、50和100 µg·L-13个浓度添加水平,平均添加回收率为78.4%&#x%,批内变异系数为10.8%&#x%,符合残留检测的需求。特异性试验表明,试验建立的卡那霉素荧光微球免疫层析方法对其他常见的氨基糖苷类药物的交叉反应率均<1%,说明方法特异性良好。【结论】 所建立方法快速灵敏、简单有效,特异性好,具有推广价值。
Development of a Microsphere-Based Fluorescence Immunochromatographic Assay for Detection of Kanamycin
ZHOU Jie2,
WANG Jian-fen3,
DING Shuang-yang2,
LI Xiu-bo1
1Feed Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences/National Feed Drug Reference Laboratories, Beijing 100081
2College of Veterinary Medicine, China Agricultural University/National Reference Laboratory for Residues of Veterinary Drugs, Beijing 100193
3Yanqing County Animal Husbandry Technical Advice Station of Beijing, Beijing 102100
【Objective】 Kanamycin is a common drug that is used for the treatment of bacterial diseases in dairy cattle, and its residue in milk can not be ignored. Fluorescent microsphere, as a new type of fluorescence tracer, has presented a unique advantage towards the detection of small molecules in recent years. This study introduces a fluorescent microsphere immunochromatographic quantitative method for detecting kanamycin in milk, which provides a rapid and effective screening means for monitoring kanamycin residues. 【Method】 Two coating antigens of KANA (KANA-GA-OVA1, KANA-I2-OVA2) were developed by glutaraldehyde method and NaIO4 method. After purification of anti-KANA monoclonal antibody by protein G immune affinity column, the antibody was coupled with fluorescent microspheres using EDC for the preparation of antibody-fluorescent microsphere conjugates (FM-mAbs). The immunochromatographic strip test was conducted as follows: NC membrane was coated with kanamycin antigen as a reaction carrier, (FM-mAbs) incubated with the sample, and allowed to migrate from below. The drug in-sample and coating antigen compete with each other for the limited FM-mAbs, and the amount of drug was evaluated by detection of the fluorescence intensity of FM-mAbs combined with coating antigen. 【Result】 It shows that the fluorescence intensity of test line gradually weakened with increasing concentrations of KANA on the sensitivity test, when drug standard solutions were added into samples at 0, 6.25, 12.5, 25, 50, 100 and 200 µg∙L-1. The F/F0 ratio was selected to express the competitive inhibition, where F0 and F are the fluorescence intensities respectively obtained from binding at zero and certain concentrations of the KANA standard. Standard curves were obtained by plotting F/F0 against the analyte concentration and fitted to a four-parameter logistic equation using Originpro 8.0 software. The dynamic range IC20-IC80was calculated as 9.5-100 µg∙L-1, and the IC50and LOD (IC10) were 24.8 and 5.0 g∙L-1, respectively. When the blank samples were spiked at 25, 50 and 100 µg∙L-1, the mean recoveries ranged from 78.4%-92.7%, with intra-assay coefficient of variations ranging from 10.8%-12.4%. The specificity of the method was evaluated by determining the cross-reactivity using other common aminoglycoside drugs. Negligible cross-reactivity (<1%) was found for these other aminoglycosides. 【Conclusion】 The method is a rapid, sensitive, simple, effective, specific and suitable for promotion and application.
fluorescent microspheres;
immunochromatography;
kanamycin;
0 引言【研究意义】卡那霉素是从卡那链霉菌的培养液中提取获得的一种氨基糖苷类抗生素。其抗菌谱与链霉素相似, 对多数革兰氏阴性菌如大肠杆菌、变形杆菌、沙门氏菌和巴氏杆菌等有效, 对结核杆菌和耐青霉素的金葡菌也有效。兽医临床上主要用于奶牛金葡菌感染的乳房炎、禽霍乱和雏鸡白痢等疾病治疗, 特别是奶牛结核性乳房炎的治疗[]。不过该药品进入动物机体后与动物组织有很强的亲和力, 残留时间较长, 在奶牛应用后可伴随乳汁残留在牛奶中, 消费者直接食用这类残留超标的动物食品, 会带来潜在的危害[], 欧盟规定牛奶中卡那霉素的残留限量为150 µ g∙ L-1。因此, 开展牛奶中这种药物的残留测定检测研究、建立可靠有效的分析方法非常必要。【前人研究进展】免疫层析法是一种快速诊断技术, 始于20世纪80年代, 并于90年***始得到蓬勃发展[]。该技术自问世以来得到了广泛的发展和认可, 在医学诊断、食品安全、农业科学、环境科学、治疗监测、动物健康等方面得到了广泛的应用[]。免疫层析法中最常用的标记物为胶体金和单分散乳胶[]。目前市场上主打的产品基本都是基于以上两种标记物。随着检测方法的不断成熟及仪器设备发展, 各种不同的标记物也慢慢参与到免疫层析检测中, 如脂质体、胶态碳、荧光微球、量子点、磷光发光粉、生物发光物和酶标记物等[]。此外, 随着仪器设备的发展更新, 更高的灵敏度和定量要求慢慢成为该技术面临的挑战。荧光微球是一种负载有荧光物质的聚合物微球, 其直径可在纳米至微米级。对于荧光微球的应用, 目前主要集中在高通量药物的筛选[]、免疫分析检测[, ]、流式细胞仪技术[, ]、荧光微球编码[]、固定化酶及DNA测定[, ]等。其中, 在兽医或食品安全领域的应用报道较少, 主要集中在细菌和真菌毒素检测。宋秀玲[]制备了多羧基荧光微球免疫探针, 利用双抗体夹心荧光免疫原理, 建立了一种安全、准确、特异地检测布鲁氏菌液相芯片检测技术; 董春梅[]进行了单核细胞增生李斯特菌单克隆抗体制备及荧光微球免疫层析试纸条的研制工作; Xie等[]建立了检测大肠杆菌O157:H7双抗体夹心胶体金试纸和荧光微球试纸方法, 并从标记效率、方法灵敏度进行了系统的比较。李?[]建立了玉米中伏马菌素荧光微球免疫层析方法。对兽药检测报道主要有：Bian等[]于2013年报道了血清、牛奶及动物组织中头孢氨苄检测的荧光微球免疫试纸条; 崔浩[]建立了猪尿中莱克多巴胺（RAC）荧光微球免疫层析快速检测方法; Chen等[]于2013年报道了牛奶中磺胺二甲基嘧啶荧光微球试纸条方法。Zhou等[]于2014年报道了牛奶、蜂蜜、牛肉等样品中林可霉素的荧光微球试纸条定量方法。【本研究切入点】到目前为止, 还没有关于基于荧光微球标记的卡那霉素免疫层析试纸定量方法的报道。【拟解决的关键问题】本研究在实验室前期基础上, 进行了卡那霉素荧光微球免疫层析定量方法（fluorescent immunochromatography, FLIC）的建立, 旨在为牛奶中卡那霉素药物的快速筛选提供新型有效的检测手段。1 材料与方法试验于2013年9月至2014年9月在中国农业大学国家兽药残留基准实验室和中国农业科学院国家饲料药物基准实验室进行。1.1 试验材料卡那霉素（KANA, 1 mg：694单位）购于中国兽药监察所, 羊抗鼠IgG（2.4 mg∙ mL-1）购于美国Jackson公司, 单克隆抗体为北京维德维康生物技术有限公司惠赠, FluoSpheres� 羧基修饰的荧光微球（直径0.2 µ m, 激发波长580 nm/发射波长605 nm）购于美国Life公司, 鸡卵清白蛋白（OVA）、聚乙二醇（PEG 40, 000）、吗啉乙磺酸（MES）、葡聚糖20000购于美国Sigma-Aldrich公司。NC膜购于美国Millipore公司, 样品垫等耗材购于上海杰一生物公司。实验室用水均为Milli-Q超纯水。ESE-试纸条读数仪购于德国Qiagen 公司, XYZ三维划膜仪购于美国BioDot公司, 裁条机购于上海金标生物公司。1.2 方法原理方法原理如所示。牛奶样品中的游离药物与包被抗原共同竞争荧光微球标记的单克隆抗体, 有药物存在时, 检测线不显色, 无药物时, 检测线显色。图1Fig. 1 图1 荧光免疫层析试纸条组装及方法原理示意图Fig. 1 Schematic diagram of assembly and method principle for FLIC strip1.3 包被抗原的制备根据以前文献报道[]制备两种卡那霉素的包被抗原。采用方法为戊二醛法（GA）制备卡那霉素包被抗原1（KANA-GA-OVA1）, 投料比（KANA:OVA）=90:1（摩尔浓度比）。方法如上。其中硫酸卡那霉素60 mg, OVA 50 mg。采用方法为过碘酸钠法制备卡那霉素包被抗原2（KANA-I2-OVA2）, 投料比（KANA:OVA）=70:1（摩尔浓度比）。1.4 抗体的纯化与标记经鉴定, 卡那霉素单克隆抗体的亚型为IgG1, 其轻链为Kappa链。在荧光微球标记抗体之前, 采用商品化蛋白G免疫亲和柱对卡那霉素单克隆抗体进行纯化和浓缩。取1 mL MES 缓冲溶液中加入一定量抗体, 涡动至均匀混合后加入荧光微球, 轻轻上下颠倒离心管, 让其充分分散至均匀胶冻状, 室温下避光放置15— 20 称取20 mg的EDC, 使用以前用纯水配制成100 mg· mL-1, 按照与荧光微球一定比例条件加入到反应体系中, 现用现配; 轻轻上下颠倒离心管, 让其充分分散。室温条件下避光反应2 h, 可使用旋转摇床, 转速控制在30 r/min以下; 每管加入200  L 0.1mol· L-1 甘氨酸溶液进行多余位点的封闭, 室温下避光反应1 h, 12 000 r/min 离心15 min（4℃条件下）, 弃上清, 重复离心一次后, 用200  L复溶液充分溶解, 4℃避光处保存备用。1.5 试纸条制备使用BIODOT划膜仪（XYZ-3050型）进行NC膜上抗原和羊抗鼠IgG的包被, 将聚酯纤维膜浸泡在处理液（含20%PVP的0.4 mol· L-1 PB溶液）中1 h, 取出放置37℃培养箱内烘干备用。依次粘贴NC膜、吸水垫、样品垫于背板上, 使用Goldbio� 裁条机将组装好的试纸条大板裁成3.5 mm宽度的试纸条; 将试纸条分类放入自封袋中, 加入干燥剂, 阴凉干燥处保存备用。1.6 牛奶样品处理取2 mL牛奶样品于5 mL离心管中, 每管加入200 µ L铁氰化钠和100 µ L硫酸锌溶液, 充分涡动10 s后, 6 000 r/min离心5 min。分层良好, 取上清液用于测定分析。1.7 检测步骤将1  L荧光微球标记的单克隆抗体加入到微孔板中（透明与不透明微孔均可）; 加入120  L标准品或样品提取液, 反复吹打混匀; 避光条件下, 将试纸条垂直插入微孔中, 样品垫端朝下, 反应15 min后, 将试纸条放入37℃恒温箱内烘干, 取出后置于紫外灯下观察T线与C线显***况或通过荧光读数仪对试纸条荧光强度进行读数和分析。1.8 方法灵敏度基于方法优化条件, 分别向微孔中加入0、6.25、12.5、25、50、100、200 µ g· L-1 7个浓度梯度的标准品溶液, 用荧光读数仪测定T线荧光信号值, 以无标准品抑制的荧光峰高值为F0值, 相应浓度标准品抑制时的荧光峰高值为F值, 以F/F0为纵坐标, 以标准品浓度为横坐标, 绘制标准曲线。利用Originpro 8.0 软件将标准曲线拟合为四参数方程, 计算方法的灵敏度。1.9 准确度和精密度取经仪器确证过的空白牛奶样品, 分别添加25、50和100 µ g· L-13个浓度水平的卡那霉素, 并设置空白对照。样品经前处理后, 每份提取样品用6个试纸条进行检测, 计算平均测定值、平均回收率及批内变异系数。1.10 方法特异性分别采用不同浓度的卡那霉素（KANA）、庆大霉素（GEN）、链霉素（STR）、安普霉素（APR）和新霉素（NEO）进行试纸条测定, 计算各药物的IC50, 根据以下公式计算出各药物的交叉反应率。交叉反应率（CR）%=IC50 (KANA)/IC50(其他同类药物) × 100%1.11 实际样品测定取10个空白奶样, 编号1#— 10#, 随机添加卡那霉素标准品, 室温下静置15 min后, 制备成10个盲样, 分别采用本文建立的荧光免疫层析法和LC-MS/MS方法进行测定, 比较测定结果, 拟合线性回归方程。其中, LC-MS/MS方法依据标准为：GB/T 奶粉和牛奶中链霉素、双氢链霉素和卡那霉素残留量的测定液相色谱-串联质谱法, 方法的检出限为10.0  g· kg-1。2 结果2.1 包被抗原的筛选试验中发现, 两种包被抗原的显色还是有明显的差异, KANA-GA-OVA1的T线可以看到明显的荧光条带, 同时C线的荧光条带也非常明显, 而对于KANA-I2-OVA2来说, T线处的荧光条带非常弱, 说明这个包被原与抗体的亲和力较弱, 结合较少, 所以荧光微球标记的抗体向上虹吸, 与二抗结合, 导致C线的荧光条带亮度明显增加。因此, 选择KANA- GA-OVA1包被抗原进行后续试验的研究。2.2 抗原与抗体配对经过初步工作浓度筛选, 分别选择不同的抗原抗体工作浓度进行配对, 结果如所示。试验中发现, 抗体标记量为4 µ g时, 抑制率情况较好, 其中抗原160倍稀释时, 含有药物的试纸条荧光强度抑制率为55.8%, 抗原320倍稀释时, 含有药物的试纸条荧光强度抑制率为61.7%, 但320倍稀释时, 零标的荧光条带峰高只有156.6 mV, 肉眼观察颜色太浅。因此, 选择抗体标记量为4 µ g, 包被抗原稀释160倍。表1Table 1表1(Table 1)
表1 棋盘法优化抗原和抗体工作浓度
Table 1 Optimize concentration of antigen and antibody by checkerboard method抗原Antigen抗体Antibody4 µ g8 µ g0 µ g· L-150 µ g· L-1抑制率Inhibition (%)0 µ g· L-150 µ g· L-1抑制率 Inhibition (%)1:80328.5179.745.3543.5314.742.11:120315.3163.348.2496.2262.047.21:160298.2131.855.8466.5224.951.81:320156.661.760.6425.1192.154.8
表1 棋盘法优化抗原和抗体工作浓度
Table 1 Optimize concentration of antigen and antibody by checkerboard method2.3 方法灵敏度试验中发现, 随着卡那霉素药物浓度的增加, 试纸条T线的荧光强度逐渐减弱, 呈现抑制状态, 如所示。图2Fig. 2 图2 肉眼观察卡那霉素荧光微球免疫层析条抑制情况Fig. 2 Inhibition results of KANA FLIC by naked eye以无标准品抑制的荧光峰高值为F0值, 相应浓度标准品抑制时的荧光峰高值为F值, 以F/F0为纵坐标, 以标准品浓度为横坐标, 绘制标准曲线。利用Originpro 8.0 软件将标准曲线拟合为4参数方程。如所示。拟合的四参数方程为 y=204.8/(1+(x/24.8)0.4) -43.9, R2为0.9998, 标准曲线的IC50值为24.8 µ g· L-1, 线性范围（以20%— 80%抑制率对应的浓度计算）为9.5� µ g· L-1, 最低检出限（以10%抑制率对应的浓度计算）为5 µ g· L-1。图3Fig. 3 图3 卡那霉素荧光微球免疫层析方法标准曲线Fig. 3 Standard curve of KANA FLIC assay2.4 准确度和精密度采用添加回收试验对本研究建立的方法进行准确度和精密度的考察。取经仪器确证过的空白牛奶样品, 分别添加25、50和100 µ g· L-13个浓度水平的卡那霉素, 并设置空白对照。样品进行前处理, 每份提取样品用6个试纸条进行检测, 计算平均测定值、平均回收率及批内变异系数。由可以看出, 卡那霉素在牛奶样品中的平均添加回收率为78.4%�%, 批内变异系数为10.8%�%, 符合残留检测的需求。表2Table 2表2(Table 2)
表2 牛奶样品中KANA添加回收率（n=6）
Table 2 Recoveries and CVs of KANA in milk by FLIC assay添加浓度Spiked (µ g· L-1)平均测定值Average measured value (µ g· L-1)平均回收率Average recovery (%)批内变异系数Intra-assay CV (%)2523.292.712.45041.482.810.810078.478.414.6
表2 牛奶样品中KANA添加回收率（n=6）
Table 2 Recoveries and CVs of KANA in milk by FLIC assay2.5 方法特异性根据1.10所述公示计算交叉反应率, 见所示。试验建立的卡那霉素荧光微球免疫层析方法对其他常见的氨基糖苷类药物的交叉反应率均< 1%, 说明本方法对卡那霉素的检测是特异性的。表3Table 3表3(Table 3)
表3 卡那霉素荧光微球免疫层析方法交叉反应率
Table 3 Cross-reactivity with other compounds by KANA FLIC assay标准品名称 Compounds交叉反应率 Cross-reactivity (%)KANA100GEN< 1STR< 1APR< 1NEO< 1
表3 卡那霉素荧光微球免疫层析方法交叉反应率
Table 3 Cross-reactivity with other compounds by KANA FLIC assay2.6 实际样品测定采用本方法和GB方法共同测定10个牛奶盲样, 以初步评价本方法的有效性。结果如所示。两种方法测定的结果相关性良好（R² = 0.9881）, 符合一元线性方程, y = 1.0336x - 0.1315。比对结果说明, 本文建立的FLIC方法可靠, 适合牛奶中卡那霉素的快速筛选检测。图4Fig. 4 图4 牛奶盲样中卡那霉素的检测结果比较Fig. 4 Comparison of detection results of blind milk samples for KANA by FMIA and LC-MS/MS（n=3）3 讨论3.1 荧光微球选择试验中选用的荧光微球的载体为聚苯乙烯, 表面呈多孔状态, 里面包覆各种不同颜色的荧光染料。再将含有羧基基团的聚合物连接到微球表面, 形成表面羧基修饰的功能性荧光微球, 可以与蛋白质发生共价结合, 制备成荧光标记物[]。根据李?[] 的报道, 试验中最初选择了常见的两种荧光微球, 一种是0.2 µ m 红色荧光（580/605 nm）羧基修饰的微球, 一种是0.2 µ m 黄绿色荧光（505/515 nm）羧基修饰的微球。整个标记过程原理和步骤相同, 但在紫外灯下观察荧光条带时发现, 红色荧光条带清晰明显, 而黄绿色的条带不明显, 与暗背景之间的色差较小, 且亮度太低, 不太适合肉眼观察。因此, 后续的试验均采用红色的荧光微球进行。3.2 方法条件优化荧光微球与胶体金的一大区别在于标记物的体积。一般常规用于标记的胶体金的直径在20 nm左右, 而试验中选用的荧光微球直径在200 nm, 是胶体金直径的10倍。因此, 在方法优化时, 要重点考虑标记物的稀释溶液体系及试纸条组装材料的选择。常规的标准品稀释液为去离子水、PBS溶液或其他缓冲液体系。试验初期使用去离子水和PBS溶液进行标准品稀释, 后将标准品与荧光微球抗体标记物进行混合孵育, 插入试纸条检测。结果发现, 荧光微球标记物并没有有效的实现层析, 而标准品与之发生水样分离, 因毛细作用迅速浸润试纸, 因此在试纸条上没有看到任何条带。吐温-20是一种表面活性剂, 它是一类既有亲水的部分又有亲油的部分的大分子, 具有能促进植物吸收在水中不能溶解的大分子, 也能帮助水分透过一些含脂高的生物膜的特性。参考免疫胶体金稀释液的选择原则, 将PBS溶液中加入了0.5%的吐温-20, 大大的增加了荧光微球标记物的分散性和层析性, 在试纸条上可以看到非常清晰地两条荧光条带。孔径大小的区别影响着样品层流速度, 孔径太大时, 样品层流速度快, 在T线停留的时间较短, 方法的灵敏度不高。而孔径太小时, 样品层流速度慢, 容易出现样品堆积现象, 或增加了非特异性吸附的可能。试验选择了Millipore180、Pall Vivid170、Sartorius CN95、Sartorius CN140、Whatman AE99、Millipore 135、Whatman Immunopore RP和Pall Vivid90共8种NC膜, 结果发现8种NC膜T线的荧光响应值的变化范围从303.92 mV至2 102.33 mV, 荧光条带较深的主要为Sartorius CN140、Sartorius CN95和Millipore 135, 条带最浅的是Whatman AE99型号。同时, 在试验过程中, 对于样品的层流速度并没有太大的差异, 孔径最大的Sartorius CN95, 层流的速度快一些, 但荧光信号也比较好, 说明对NC膜的选择中孔径大小的区别不是影响荧光信号最直接的原因, 主要还是各种膜的不同制造工艺对抗原包被效率有所影响造成的。3.3 基质效应由于信号模式不同, 荧光免疫层析方法与胶体金免疫层析方法, 更容易受到基质的干扰, 特别是牛奶样品。对于胶体金免疫分析来说, 判断是在可见光下通过肉眼进行的, 因此牛奶样本的偏白色背景与试纸条检测背景相同, 不会对肉眼判断造成干扰; 而对荧光免疫分析来说, 肉眼观察的视野是在紫外灯下, 检测背景为黑色或深蓝色, 而牛奶成分中的某些蛋白质含有共轭或苯环结构, 受到紫外光或蓝紫光照射时, 可激发成为激发态, 当从激发态恢复至基态时, 发出荧光, 对反应造成干扰。顾春峰等[]对42种牛奶水溶液的荧光光谱进行了研究, 在7种不同的激发波长下, 牛奶水溶液均可以获得一定的荧光发射峰。在本试验研究中, 将牛奶样品进行2倍系列稀释后上样检测, 观察样品层析及荧光条带的亮度。结果发现, 没有稀释的牛奶样品无法完成有效地层析, 2倍稀释的牛奶样品可以完成层析, 但是没有显示T线, 4倍稀释以上的牛奶样品, 可以获得有效的T线和C线。但在紫外灯下, 整个试纸条呈现一片淡淡的白色, 影响观察。随后, 将牛奶样品进行沉淀蛋白, 选择3%的三氯乙酸和0.4 mol· L-1亚硝基铁氰化钠-1 mol· L-1ZnSO4分别对牛奶样品进行处理, 离心后取上清用于试纸条测定。结果发现, 亚硝基铁氰化钠-ZnSO4主要通过吸附作用沉淀蛋白, 离心后分层明显, 且试纸条测试时发现荧光条带明显, 检测背景较干净, 而三氯乙酸主要依靠酸性来促使蛋白变性沉淀, 离心后分层也比较明显, 试纸条检测是发现, T线条带亮度非常小, 有些根本没有出现T线。因此, 试验选择0.4 mol· L-1亚硝基铁氰化钠-1 mol· L-1 ZnSO4对牛奶样品进行处理。此外, 为了加强牛奶样品迁移率, 试验还对试纸条组装材料进行了改进。（1）样品垫筛选：选择微细玻纤滤血膜材料作为样品垫, 该材料较厚（0.85 mm）, 吸水性能较好（75.2 L· m-2· s-1）, 比较适合粘滞度较大的样品溶液, 如牛奶和血清等; （2）吸水垫长度：试验中还比较了不同长度的吸水垫（2.2、2.8和3.2 cm）对样品迁移率的影响, 从试验结果来看, 吸水垫越长, 毛细作用越强, 样品的迁移率越好。不过过长的吸水垫会造成样品垫长度的缩短。所以, 试验最后选择了中等长度的吸水垫（2.8 cm）作为组装材料。4 结论首次建立了基于荧光微球标记的卡那霉素免疫层析试纸定量方法, 并用于牛奶的检测。该方法为一种定量方法, 可以特异性检测牛奶样品中卡那霉素的残留。方法的最低检出限为5 µ g· L-1, IC50值为24.8 µ g· L-1。以25、50和100 µ g· L-1浓度添加试验表明, 卡那霉素在牛奶样品中的平均添加回收率为78.4%�%, 批内变异系数为10.8%�%, 符合残留检测的需求。特异性试验表明, 对其他氨基糖苷类药物无交叉。荧光微球免疫层析技术与传统的胶体金免疫层析技术相比, 具有独特的优势, 特别是其在定量化方面的前景, 非常符合近些年来快速诊断技术定量化的发展要求, 并且可以获得较高的灵敏度。不过, 荧光微球免疫层析技术在产业化道路上的推广, 还需要解决一些实际问题, 如荧光微球的成本高、批间变异大、检测设备贵及标记物稳定性差等。
The authors have declared that no competing interests exist.
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... 兽医临床上主要用于奶牛金葡菌感染的乳房炎、禽霍乱和雏鸡白痢等疾病治疗,特别是奶牛结核性乳房炎的治疗[1] ...
. 2011, (in Chinese):-
动物源性食品中抗生素残留是食品安全领域的一个重要问题,抗生素 通过食物长期的摄入体内后将使人体产生抗生素耐药性,因此食品中抗生素的残留监测极为重要。本论文对动物源性食品中氨基糖苷类抗生素残留分析的样品前处理 技术、终端检测方法等进行了系列研究,建立了灵敏度高、专属性强、普适性好的固相萃取-高效液相色谱-串联质谱分析方法,可对肉类、乳制品、动物内脏等动 物源性食品进行有效监控。 　　 论文主要内容如下: 　　 1.对氨基糖苷类抗生素在家畜饲养中的使用、动物源性食品中的残留及其对人体产生的危害进行了介绍,就残留分析方法现状进...
... 不过该药品进入动物机体后与动物组织有很强的亲和力,残留时间较长,在奶牛应用后可伴随乳汁残留在牛奶中,消费者直接食用这类残留超标的动物食品,会带来潜在的危害[2],欧盟规定牛奶中卡那霉素的残留限量为150 #cod#x000b5 ...
... 【前人研究进展】免疫层析法是一种快速诊断技术,始于20世纪80年代,并于90年***始得到蓬勃发展[3] ...
... 该技术自问世以来得到了广泛的发展和认可,在医学诊断、食品安全、农业科学、环境科学、治疗监测、动物健康等方面得到了广泛的应用[4] ...
... 免疫层析法中最常用的标记物为胶体金和单分散乳胶[5] ...
... 随着检测方法的不断成熟及仪器设备发展,各种不同的标记物也慢慢参与到免疫层析检测中,如脂质体、胶态碳、荧光微球、量子点、磷光发光粉、生物发光物和酶标记物等[6] ...
Hu J , Liu B L , Wang D Q.
胡杰, 刘白玲, 汪地强
... 对于荧光微球的应用,目前主要集中在高通量药物的筛选[7]、免疫分析检测[8,9]、流式细胞仪技术[10,11]、荧光微球编码[12]、固定化酶及DNA测定[10, 13]等 ...
Yu M , Zou M Q , He S Y.
于淼, 邹明强, 何昭阳
新近发展的高分子微球具有粒度均一、稳定性好、可连接多种生物活性物质从而便于多参数分析等优点,在生物医学领域有广泛的应用.本文主要阐述了高分子荧光微球在免疫分析、高通量药物筛选、药物载体、固定化酶、细菌和病毒诊断、单个核苷酸多态性基因型、细胞因子鉴定以及单细胞分析等方面的应用,并简介了某些最新进展.
... 对于荧光微球的应用,目前主要集中在高通量药物的筛选[7]、免疫分析检测[8,9]、流式细胞仪技术[10,11]、荧光微球编码[12]、固定化酶及DNA测定[10, 13]等 ...
. 2008, (in Chinese):-
荧光微球是指直径在纳米级至微米级范围内，负载有荧光物质，受外 界能量刺激能激发出荧光的固体微粒。其外形可为任意形状，典型的外形为球形。荧光微球的载体多为有机或无机聚合物材料。它具有相对稳定的形态结构和发光行 为，受外界条件如溶剂、热、电、磁等的影响比纯粹的荧光化合物要小，其作为一种新型的载体材料已广泛应用于生物医学领域。 本文分别用种子聚合法和分散聚合法制备了荧光微球，并对制备荧光微球的实验工艺，微球形貌和实验后期处理进行了对比，我们选择分散聚合法制备荧光微球。并 在此基础上进行了双荧光峰的荧光微球的制备和性能研究...
... 对于荧光微球的应用,目前主要集中在高通量药物的筛选[7]、免疫分析检测[8,9]、流式细胞仪技术[10,11]、荧光微球编码[12]、固定化酶及DNA测定[10, 13]等 ...
... 对于荧光微球的应用,目前主要集中在高通量药物的筛选[7]、免疫分析检测[8,9]、流式细胞仪技术[10,11]、荧光微球编码[12]、固定化酶及DNA测定[10, 13]等 ...
... 对于荧光微球的应用,目前主要集中在高通量药物的筛选[7]、免疫分析检测[8,9]、流式细胞仪技术[10,11]、荧光微球编码[12]、固定化酶及DNA测定[10, 13]等 ...
... 对于荧光微球的应用,目前主要集中在高通量药物的筛选[7]、免疫分析检测[8,9]、流式细胞仪技术[10,11]、荧光微球编码[12]、固定化酶及DNA测定[10, 13]等 ...
... 对于荧光微球的应用,目前主要集中在高通量药物的筛选[7]、免疫分析检测[8,9]、流式细胞仪技术[10,11]、荧光微球编码[12]、固定化酶及DNA测定[10, 13]等 ...
... 对于荧光微球的应用,目前主要集中在高通量药物的筛选[7]、免疫分析检测[8,9]、流式细胞仪技术[10,11]、荧光微球编码[12]、固定化酶及DNA测定[10, 13]等 ...
. 2013, (in Chinese):-
近年来，全球范围内新发公共传 染病不断发生，其病原体75%源自动物或动物源性食品。新发公共传染病已越来越多的呈现出“人禽共患”或“人畜共患”的特点。其中由布鲁氏菌引起的传染病 在我国尤其是在牧区发病率较高，且传染性较强。布鲁氏菌病的高发和流行不仅造成巨大的经济损失，而且严重威胁人群的健康。对布鲁氏菌病的预防、监督检查现 已引起世界各国的广泛重视，加强对布鲁氏菌的预防和监控现已纳入世界卫生组织和我国卫生部传染病检测的主要工作内容之一。因此，开发快速、高效、特异的布 鲁氏菌病检测技术现已成为公共卫生检测领域研究的重点课题之一。本课题研究主要是设计合成了多酸基荧光免疫探针，利用双抗体夹心荧光免疫原理，借助液相芯 片检测技术平台，建立一种安全、准确、特异的布鲁氏菌检测方法。本课题研究分为四个部分： 第一部分布鲁氏菌多克隆抗体与单克隆抗体的制备及鉴定。①多克隆抗体的制备及鉴定：利用羊种布鲁氏菌M5疫苗皮下多点注射免疫新西兰白兔，每次免疫前耳缘 静脉取血，测定其血清效价，达到所需标准，兔心脏采血并分离血清，用硫酸铵沉淀法结合Protein G亲和层析法进行抗体纯化，Bradford法测定抗体蛋白含量，间接ELISA、SDS-PAGE凝胶电泳试验测定效价和纯度，并利用生物素进行标记。 结果显示纯化后布鲁氏菌多抗纯度较高，蛋白含量为8.22mg?L~(-1)，效价可达到1:64000，每摩尔多克隆抗体蛋白可标记生物素摩尔数为 2.61。②单克隆抗体的制备及鉴定：采用杂交瘤细胞技术，以羊种布鲁氏菌M5为抗原免疫BALB/c小鼠，在细胞融合前4d加强免疫。取免疫小鼠脾细胞 和SP2/0细胞进行融合。用已建立的间接ELISA进行杂交瘤细胞阳性筛选，采用有限稀释法进行亚克隆，筛选出能稳定分泌M5抗体的阳性杂交瘤细胞。阳 性杂交瘤细胞经扩大培养后，小鼠体内诱生法制备单抗腹水，并对腹水中的单抗用硫酸铵沉淀法结合Protein G亲和层析法进行纯化， Bradford法测定蛋白含量，间接ELISA、SDS-PAGE凝胶电泳试验测定效价和纯度。结果显示经过亚克隆筛选出1株能稳定分泌M5单克隆抗体 的杂交瘤细胞株，抗体亚型为IgG_3型，纯化浓缩后的抗体蛋白含量为4.39mg?L~(-1)，效价可达到1:6400，纯度较高，特异性较好。 第二部分多酸基荧光发光材料的合成与表征。①采用有机无机杂化法，设计合成新型多酸荧光N(C_4H_9)_4]_2[V_6O_(13) {(OCH_2)_3CNH-CH_2-C_(16)H_9}_2化合物。利用X-射线单晶衍射、氢核磁、碳核磁、红外光谱、紫外光谱和荧光光谱对其结构 和性质进行表征。结果显示该化合物呈负电性，红外光谱特征峰为、、、795、718cm~ (-1)，紫外特征吸收峰为244、270、283、389、345nm，激发峰为262、275、329、345nm，在345nm激发下的发射波谱范 围较宽，最高发射峰在400nm处。②采用常规的多酸化学合成方法，合成Na_9EuW_(10)O_(36)，利用红外光谱、紫外光谱和荧光光谱对所合 成的化合物结构和性质进行表征。结果显示，该化合物红外光谱特征峰为543、705、785、843、945nm，紫外特征吸收峰为208和258nm， 在278nm激发下的发射峰位于579、592、619、651、692、700nm。 第三部分功能化多酸基荧光检测微球的制备与表征。①功能化多酸荧光染料[N(C_4H_9)_4]_2[V_6O_(13){(OCH_2)_3CNH- CH_2-C_(16)H_9}_2]标记聚苯乙烯微球的制备与表征：采用分散聚合法合成聚苯乙烯微球，微球粒径约为2.8μm，选用聚电解质 PDADMAC、PAA、PAH对微球进行活化，采用层接层静电自组装法将所制备的多酸荧光染料[N(C_4H_9)_4]_2[V_6O_(13) {(OCH_2)_3CNH-CH_2-C_(16)H_9}_2]包覆在微球表面，通过聚电解质进一步修饰，使微球表面带有羧基官能团。利用Zeta电 位、荧光光谱和激光共聚焦显微镜对所制备的微球进行表征，结果显示多酸荧光染料和聚苯乙烯微球可以较好的偶联，且具有良好的荧光发光特性。②功能化多酸荧 光染料[N(C_4H_9)_4]_2[V_6O_(13){(OCH_2)_3CNH-CH_2-C_(16)H_9}_2]标记二氧化硅微球的制备与 表征：采用种子聚合法合成二氧化硅微球，微球粒径约为1μm，选用聚电解质PEI和PAA对微球进行活化，采用层接层静电自组装法将所制备的多酸荧光染料 [N(C_4H_9)_4]_2[V_6O_(13){(OCH_2)_3CNH-CH_2-C_(16)H_9}_2]包覆在微球表面，通过聚电解质进 一步修饰，使微球表面带有羧基官能团。利用Zeta电位、荧光光谱和流式细胞仪对所制备的微球进行表征。结果显示多酸荧光染料和二氧化硅微球可以较好的偶 联，且具有良好的荧光发光特性。③功能化多酸荧光染料Na_9EuW_(10)O_(36)标记聚苯乙烯微球的制备与表征：采用细乳液聚合法将 Na_9EuW_(10)O_(36)杂化引入聚苯乙烯微球中，通过聚电解质进一步修饰，使微球表面带有羧基官能团。利用紫外光谱、荧光光谱、Zeta电 位和透射电镜对所制备的微球进行表征。结果显示Na_9EuW_(10)O_(36)与聚苯乙烯微球可以较好的杂化，且具有良好的荧光发光特性。 第四部分布鲁氏菌液相芯片检测方法的建立及评价。①布鲁氏菌液相芯片检测方法的建立：利用双抗体夹心荧光免疫分析原理，采用液相芯片检测技术平台，通过对 反应条件的优化，建立一种布鲁氏菌液相芯片检测方法，并对该方法的检测效果进行验证。结果显示，本课题所建立的检测方法最佳反应条件为：单抗最佳偶联浓度 8.3125μg?mL~(-1)，生物素标记的多克隆抗体工作浓度为432μg?mL~(-1)，SA-PE的工作浓度为8μg?mL~(-1)。该方 法检测的特异性和重复性较好，利用该方法检测羊布鲁氏菌M5最低检出限为1.0×10~6CFU?mL~(-1)。②布鲁氏菌液相芯
... 宋秀玲[14]制备了多羧基荧光微球免疫探针,利用双抗体夹心荧光免疫原理,建立了一种安全、准确、特异地检测布鲁氏菌液相芯片检测技术 ...
. 2013, (in Chinese):-
单增李斯特菌(Listeria monocytogenes，LM)是一种能引起人畜共患病的食源性致病菌。该菌可通过食物、水和动物粪便等传播，在低温4℃下仍能生长繁殖，人被LM感 染后死亡率可达30％，在新生婴幼儿和免疫力低下的人群中死亡率更高达70％。获得高亲和力李斯特菌特异性抗体是建立免疫学检测李斯特菌的必要条件之 一。 　　 本文以LM的细胞碎片免疫BALB/c小鼠，成功筛选获得了4株稳定分泌抗LM的单克隆杂交瘤细胞株4A7、4H11、10A11、11E11。抗体效价 分别为1∶∶20000;抗体亚型分别为IgG1、IgG2a、IgG1、IgG2a。Dot- ELISA结果表明，4A7、10A11和...
... 董春梅[15]进行了单核细胞增生李斯特菌单克隆抗体制备及荧光微球免疫层析试纸条的研制工作 ...
... Xie等[16]建立了检测大肠杆菌O157:H7双抗体夹心胶体金试纸和荧光微球试纸方法,并从标记效率、方法灵敏度进行了系统的比较 ...
. 2013, (in Chinese):-
摘　要： 本研究建立了用于检测粮食，饲料中伏马菌素Ｂ１的快速，灵敏，简便的免疫检测方法－建立在单克隆抗体基础上的直接竞争性酶联免疫吸附测定方法；其最低检出浓度为１０ｎｇ／ｍｌ，线性范围在１０ｎｇ－５μｇ／ｍｌ。竞争
... 李?[17]建立了玉米中伏马菌素荧光微球免疫层析方法 ...
... 根据李?[17] 的报道,试验中最初选择了常见的两种荧光微球,一种是0 ...
... 对兽药检测报道主要有：Bian等[18]于2013年报道了血清、牛奶及动物组织中头孢氨苄检测的荧光微球免疫试纸条 ...
. 2012, (in Chinese):-
目的：依据免疫竞争层析方法的 原理，建立莱克多巴胺（RAC）荧光微球免疫层析快速检测方法。研制莱克多巴胺荧光微球免疫层析试纸条，用于猪尿中莱克多巴胺残留的检测。 方法：采用饱和硫酸铵沉淀法纯化抗RAC单抗小鼠腹水，并用BCA试剂盒测定其抗体蛋白浓度。以EDC作为偶联剂，将本实验室制备的抗RAC单抗偶联到商 用聚苯乙烯荧光微球表面，合成出荧光微球抗体复合物。将标记好的复合物喷涂于结合垫上；采用活性酯法合成RAC-BSA检测抗原并将其包被在NC膜表面作 为检测线(T线)；羊抗鼠IgG包被在硝酸纤维素（NC）膜表面作为质控线(C线)；筛选并优化复溶液及样品垫预处理液中的各项成分及浓度。将结合垫、吸 水纸和处理过的样品垫最后组装成试纸条。试纸条检测过程中RAC-BSA与待测样品中RAC竞争结合有限的荧光微球标记RAC单抗，如果样品中的RAC含 量多则其结合荧光微球标记的抗体多，则结合到T线的荧光微球抗体复合物越少，于450nm激发光下观察，则T线的荧光强度越低，因此可根据荧光强度的强弱 检测判断样品中RAC的多寡。 结果：合成出检测抗原RAC-BSA。合成得到了荧光微球抗体复合物，该复合物与检测抗原有很好的结合，且与BSA不存在非特异性结合。建立了RAC荧光 快速检测方法，制备出了RAC荧光微球免疫层析试纸条，该试纸条检测猪尿中RAC的残留，灵敏度最低值为2ngmL~(-1)，与克伦特罗（CL），沙丁 胺醇（SAL）等类似物无交叉反应。 结论：本研究建立的莱克多巴胺荧光微球免疫层析快速检测技术操作便捷，稳定可靠，灵敏度高，可作为猪尿中莱克多巴胺残留现场检测和监控的有效手段。
... 崔浩[19]建立了猪尿中莱克多巴胺（RAC）荧光微球免疫层析快速检测方法 ...
... Chen等[20]于2013年报道了牛奶中磺胺二甲基嘧啶荧光微球试纸条方法 ...
... Zhou等[21]于2014年报道了牛奶、蜂蜜、牛肉等样品中林可霉素的荧光微球试纸条定量方法 ...
... 3 包被抗原的制备根据以前文献报道[22]制备两种卡那霉素的包被抗原 ...
... 再将含有羧基基团的聚合物连接到微球表面,形成表面羧基修饰的功能性荧光微球,可以与蛋白质发生共价结合,制备成荧光标记物[23] ...
. ):107-111
Gu C F , Lan X F , Yu Y S , Lu L P.
顾春峰, 兰秀风, 于银山, 卢礼萍
Six kinds of samples are collected including pure milk, milk with high calcium and milk with high calcium but low fat producted by Inner Mongolia Yili Industrial Group Co.,Ltd.and Inner Mongolia Mengniu Dairy (Group) Co.,Ltd.respectively.0.17 mL, 0.20 mL, 0.23 mL, 0.26 mL, 0.29 mL, 0.32 mL, 0.35 mL of the six kinds of samples are added into 5mL deionized water, and 42 pieces of milk solution are obtained.Hitachi F-4600 fluorescence spectrophotometer is used to obtain the fluorescence spectra of the samples under excitation wavelength at 315 nm, 320 nm, 325 nm, 330 nm, 335 nm, 340 nm, 345 nm respectively.After Savitzky-Golay smoothing and FFT low-pass filtered, each fluorescence spectrum is decomposed by Gauss multi-dimensional fitting, then 5 element gauss peak appeared.Each element Gauss peak position of all milk peroxide solution is invariable under the same stimulation wave length.All element Gauss peaks are red shifted along with the stimulation wave length increasing.Under the long stimulation wave length, each element Gauss peak of milk with high calcium but low fat is bigger than the others.Milk density plays an unimportant role to the total fluorescence spectrum.
采集伊利、蒙牛公司生产的纯牛奶、高钙奶、高钙低脂奶,向5 mL去离子水中分别加入0.17 mL、0.20 mL、0.23 mL、0.26 mL、0.29 mL、0.32 mL、0.35 mL这6种牛奶样品,得到42份牛奶水溶液.采用日立F-4600荧光光谱仪测定样品在波长为315 nm、320 nm、325 nm、330 nm、335 nm、340 nm、345 nm激发光诱导下的荧光发射光谱,对所得荧光光谱进行Savitzky-Golay平滑、FFT低通滤波后,利用高斯***法对荧光谱线进行***,将每个荧光光谱***为5个基元高斯峰.讨论了各种牛奶发射光谱的规律和变化趋势,结果表明:所有牛奶水溶液的各个基元高斯峰,在相同激发波长下,其峰值位基本不变,当激发波长变化时,所有基元高斯峰会随激发波长的增加而红移;高钙低脂奶在波长较长的激发光照射下,各个基元高斯峰强度均大于纯牛奶和高钙奶;牛奶的浓度对总荧光光谱的影响较小.
... 顾春峰等[24]对42种牛奶水溶液的荧光光谱进行了研究,在7种不同的激发波长下,牛奶水溶液均可以获得一定的荧光发射峰 ...
一种基于荧光微球标记的卡那霉素免疫层析定量方法的建立
[徐飞1, 周洁2, 吴超2, 王建芬3, 丁双阳2, 李秀波1]