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蓝藻色素蛋白的生物合成及应用分析.pdf 133页
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蓝藻色素蛋白的生物合成及应用分析
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--------------------------Page1------------------------------华中科技大学博士学位论文或cpcB）在大肠杆菌体内共表达，产生了色素蛋白PVB-PecA、PUB-PecA、PCB-CpcB(C-84)、PCB-CpcB(C-155)、PEB-CpcB(C-84)和PEB-CpcB(C-155)。其光谱特征与简化前基本一致。通过荧光显微镜的观察，可以看到不同颜色、明亮的荧光细胞。藻胆色素蛋白的优点是具有较高的荧光量子产率，但也有非常明显的缺陷，即它的合成不仅需要色素合成酶、还需要裂合酶的参与。最近，蓝细菌光敏色素的研究已经有GAFPΦBBVPCB了一些进展，它的结构域能够自催化的结合各种色素，包括、、、甚至PVB，这比藻胆蛋白作为可基因编码的荧光探针具有更大的优点。本论文把实验室已有的来自于Synechocystissp.PCC6803中的基因slr1393的一个GAF结构域编码基因gaf3与色素合成酶基因进行大肠杆菌体内共表达，产生了色素蛋白PCB-GAF3和PΦB-GAF3。光谱分析表明，它们是红色、远红色荧光蛋白，最大荧光值到达670nm和690nm，并且具有独特的红绿光转换的可逆光致变色效应。尽管GAF自催化结合色素，但是仍然需要色素合成酶基因共表达，而GFP作为荧光蛋白，不需要其他的辅助因子。因此，本论文采用首尾相连、逐步融合基因的方法解决了这个问题。ho1和pcyA先融合成一个基因编码框ho1:pcyA，然后gaf3插ho1:pcyA5’gaf3:ho1:pcyA入融合基因的末端。构建的融合基因插入表达载体后可直接诱导表达，产生的色素蛋白PCB-GAF3:HO1:PcyA与PCB-GAF3具有相同的光谱特征，包括独特的可逆光致变色效应。这些结果通过光谱分析、荧光显微镜技术、PVA复合膜实验得以证实。当用藻胆蛋白编码基因apcA代替gaf3时，也能产生荧光色素蛋白PCB-ApcA:HO1:PcyA，这说明融合基因的方法具有普遍的意义。色素荧光蛋白优异的光谱性质是GFP家族荧光蛋白的很好补充，尤其是它具有的红色荧光和可逆光控开关效应将为组织深度成像、超分辨显微技术、甚至三维数据存储技术提供便利。关键词：关键词：关关键键词词：：藻胆蛋白裂合异构酶蓝细菌光敏色素荧光色素蛋白融合基因GAF结构域可逆光致变色II--------------------------Page2------------------------------华中科技大学博士学位论文AbstractAbstractAAbbssttrraaccttCyanobacteriaisthephotosynthesismicroorganism.Phycobilisomesaremainlight-harvestingcomplexes.Phycobiliproteinsarethefunctioncompositionofthecomplexesinthealgaephotosynthesis.Biosynthesisresearchofphycobiliproteinisofgreatsignificance,contributingtotheunderstandingofthestructuralbasisandthebiochemicalmechanismofcyanobacteriaphotosynthesis,whichcancompletetheassemblyofthephycobilisomes,andalsoprovidingthenecessaryconditionsforbiosynthesisinvitroofthesefluorescentbiliproteins.ByheterologousrecombinationinvivoinE.coli,thethesisconfirmedthatCpeY/ZorCpeYcancatalyzecovalentattachmentofPEBtoCpeAofPEIsfromSynechococcussp.StrainWH8102,andPEB-CpeAhasahigheryieldundercatalysisofCpeY/Z,butneitherCpeY/ZnorCpeYcatalyzecovalentattachmentofPEBorPUBtoMpeAofPEIIs.FurtherexperimentsfoundthatthelyasesMpeU,MpeYandsoondidn’tcatalyzetheattachmentofeitherPEBorPUBtoMpeA.Althoughbiosynthesisinvitroofphycoery
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