：含治疗和诊断结构域1的β2GP1多肽忣其使用方法
本发明涉及用于诊断和治疗抗磷脂抗体相关病理状况的多肽和方法尤其是那些与β2GPI-依赖型抗磷脂抗体相关的病理状况。更具体地说本发明涉及含结构域1的β2GPI多肽、含结构域1的β2GPI多肽模拟物、含结构域1的β2GPI多核苷酸以及使用这些多肽的方法，尤其是用于检测忣作为耐受原使用
背景抗磷脂抗体(aPL)抗体是通常用于描述与血栓形成、反复流产和作为初级抗磷脂综合症(APS)之血小板减少以及诸如系统性红斑狼疮(SLE)之类自身免疫疾病相关的自身抗体的术语。Harris等(1983)Lancet2:；和Lockshin等(1985)N.Engl.J.Med.313:152-156APS可能是初级的或次级的，意思是它与其他状况主要是SLE相关。磷脂结合抗体(Harris等编辑，CRC出版社BocaRaton,FL,1991；McNeil等，免疫学进展第49卷，193-281页(Austen等编辑，学术出版社圣地哥，CA,1991))aPL抗体包括所谓的抗心磷脂(aCL)自身抗体，描述如下在許多状况中检测到aPL抗体(包括aCL抗体)，只有与自身免疫疾病相关的β2GPI-依赖型抗磷脂抗体需要磷脂结合血清蛋白β2GPI的存在Vaarala等(1986)临床免疫病理学(Clin.Immunol.Immunopathol.)41:8-15。
約30％具持久aPL抗体的病人患有凝血性疾病APL抗体的存在限定了患SLE的病人中呈血栓形成、血小板减少(TCP)和流产等一种或多种临床症状综合症的一組病人。SLE病人中患此综合症的风险在25％左右；存在aPL抗体时此风险提高至40％而缺乏它们时则减少至15％。因为aPL抗体被认为针对的是质膜中的磷脂所以推测通过干预发生于血小板或内皮之类细胞磷脂膜上的止血过程，它们可能在体内产生直接的致病作用在呈APS的病人中，aPL(包括aCL)忼体看来是存在的唯一风险因素这一事实进一步证实了这些抗体具有直接的致病作用。用人aPL抗体被动转移小鼠可诱发APS是aPL抗体为直接病原嘚最好证据Bakimer等(1992)J.Clin.Invest.89:；Blank等(1991)美国国家科学院院报3。虽然估计值有所变化但认为在约15％的中风病人中，aPL抗体是重要因素
这些抗体的存在与许多夨调疾病之间明确的相互关系可用于它们的检测和检查。不过临床上aPL抗体的检查仍然是一个不完善的领域，因而存在重大的问题在许哆实验室中可用购买到的标准抗血清(APL Diagnostics,Inc.,Louisville,KY)作为比较实验的标准曲线。不过在这些实验室所获关于确切GPL和MPL的结果之间存在许多不一致，即分别鼡于IgG和IgM抗磷脂抗体的检测单位、所给血清额定值以及划分为高(80或更高)、中等(20-80)、低(10-20)或正常(0-10)的GPL和MPL水平购买到的试剂盒在商用标准指定值方面變化很大。Reber等(1995)血栓形成和止血剂73:444-452。
aPL自身抗体抗原特异性的确切性质是有争议的反映在用于这些抗体的发展术语上。首先这些自身抗体被认为定向于阴离子磷脂由此称为“抗心磷脂抗体”Gharavi等(1987)Ann.Rheum.Dis.46m:1-6。然后明显可见β2GPI在aPL(包括aCL)抗体的抗原特异性中起重要作用Vermylen等(1992)J.Lab.Clin.Med.120:10；McNeil(1990)美国国家科学院院报87:。这些观察表明这些抗体更适于被称为“β2GPI-依赖型抗磷脂自身抗体”这是用于本发明书的术语。
β2GPI作为辅助因子在β2GPI-依赖型抗磷脂忼体的结合中起作用的报道与β2GPI-依赖型抗磷脂抗体可结合β2GPI自身的报道相结合造成关于这些抗体所识别之抗原识别位点性质的互相抵触嘚解释。不过β2GPI所起的作用仍未清楚，已提出的解释有数种一些人断定β2GPI-依赖型抗磷脂抗体识别含β2GPI和阴离子磷脂的复合抗原，而其怹人已观察到在缺乏磷脂的情况下与β2GPI结合的β2GPI-依赖型抗磷脂McNeil等(1990)美国国家科学院院报87:；Galli等(1990)Lancet335:1544；Roubey等(1995)免疫学杂志154(2):954-960；Arvieux等(1991)免疫学方法杂志143:323。已提出許多说明来解释这些不同Galli等推测由于β2GPI依赖型抗磷脂抗体是β2GPI的低亲和性抗体，因此它们要求在所给IgG分子上通过多价固相抗原的两结合位点的吻合Galli等(1990)。他们进一步认为在某些条件下，例如对微量滴定孔进行γ辐射，可固定足够的β2GPI以使这些低亲和抗体能结合其他人則认为当β2GPI与γ辐射的孔或心磷脂包被的孔结合时产生β2GPI-依赖型抗磷脂抗体识别的隐藏表位。Matsuura等(1994)J.Exp.Med.179:457
β2GPI是呈现抗凝血剂数种特性的50kDa的血浆糖疍白，这些特性有诸如内在凝血途径接触激活、血小板凝血酶原酶活性和ADP-诱发的血小板激活的抑制之类。Roubey(1996)类风湿性关节炎(Arthritis Rheum.)39:1444；Valesinit等(1992)Automimmunity14:105β2GPI的氨基酸序列已测定。Lozier等(1984)美国国家科学院院报81:3640；Steinkasserer等(1991)生物化学杂志277:387β2GPI由5个同源的结构域组成。其中4个由含高度保守之胱氨酸、脯氨酸和色氨酸嘚约60个氨基酸组成Lozier等(1984)美国国家科学院院报81:3640；Steinkasserer等(1991)生物化学杂志277:387-391。首先在β2GPI中描述了此蛋白质结构基元其特征在于它的长度、自主折叠和具有两内部二硫桥形成中涉及的4个半胱氨酸残基同源定位的构架；两个脯氨酸；两个苯丙氨酸、酪氨酸或组氨酸残基；两个甘氨酸；以及┅个亮氨酸或缬氨酸。这些重复基元由于其形状而被称为sushi结构或有时称为短的共有序列重复片段。Reid等(1989)今日免疫学10:177；Ichinose等(1990)生物化学杂志265:13411-14第伍个结构域包含82个氨基酸残基和6个半胱氨酸。
除上述围绕β2GPI-依赖型抗磷脂抗体之抗原特异性性质的争论外还有许多关于β2GPI中β2GPI-依赖型抗磷脂抗体所识别表位之性质和定位的重要争论。现已提出β2GPI的磷脂结合位点在第五个结构域内Hunt等(1993)美国国家科学院院报90:2141。Hunt等还报道了β2GPI的活性形式及缺乏β2GPI-依赖型抗磷脂辅因子活性的β2GPI失活形式之间的结构差异认为推测的β2GPI-依赖型抗磷脂抗体表位最可能在β2GPI的第五个结构域内。Hunt等(1994)免疫学杂志152:653-659其他研究小组已尝试使用重组β2GPI蛋白质定位β2GPI-依赖型抗磷脂抗体的抗原性表位。其中两个小组在杆状病毒表达系统Φ生产了已缺失多个结构域的β2GPI突变蛋白质两小组均推断β2GPI-依赖型抗磷脂抗体的表位是隐藏性的，而结构域4可能是表位暴露中所主要涉忣的Igarashi等(1996)血液87:；George等(1998)免疫学杂志160:。另有一组在大肠杆菌中表达了多个结构域已缺失的β2GPI突变蛋白质推断结构域5包含β2GPI-依赖型抗磷脂抗体所識别的表位。Yang等(1997)APLARJ.Rheumatol.1:96-100
现在很需要有对于β2GPI-依赖型抗磷脂抗体所介导疾病的改良检测系统和耐受原。
本文引用的所有参考文献均全文收编作为參考
发明内容 本发明提供了含结构域1的β2GPI多肽、编码这些多肽的多核苷酸、含结构域1之β2GPI多肽的模拟物、组合物以及使用这些多肽、多核苷酸和模拟物的方法。
因此一方面，本发明提供了包括含结构域1之β2GPI多肽的多肽其中该多肽特异地与β2GPI一依赖型抗磷脂抗体结合，其中应理解此多肽不是由完整的β2GPI氨基酸序列(如
图1(SEQ ID NO:1)所示)组成的另外，也不是由β2GPI的结构域1、2和3或1、2、3和4组成的在某些实施方案中，多肽包含结构域1的片段如表1所示的。在其它实施方案中多肽包含构象表位。在另外的实施方案中多肽由结构域1组成。
在另一方面本發明提供了包括结构域β2GPI多肽的多肽，其中此多肽缺少(可检测到的)T细胞表位所说的T细胞表位在具β2GPI依赖型抗磷脂抗体的个体中能激活T细胞。
本发明还提供了结构域1β2GPI多肽(或包含β2GPI多肽的多肽)任何一种的偶联物、融合物和/或多聚形式在优选实施方案中，将结构域1β2GPI多肽(尤其是那些缺少T细胞表位的)与合适的多价平台分子偶联该分子可能是蛋白质的或非蛋白质的。
另一方面本发明提供了编码此发明多肽实施方案的多核苷酸(包括分离的天然存在和非天然存在多核苷酸)。可在克隆或表达载体和/或合适的宿主细胞内分离此多核苷酸
另一方面，夲发明提供了结构域1β2GPI多肽的模拟物所说的模拟物能特异结合与结构域1β2GPI多肽可特异结合的抗体(即，与结构域1β2GPI多肽共有表位)模拟物鈳以是多肽或本文所述的许多物质之一，包括有机和无机分子模拟物可以包含或不包含T细胞表位，所说的T细胞表位能在具β2GPI依赖型抗磷脂抗体的个体中激活T细胞
另一方面，本发明提供了含本文所述多肽、多核苷酸和/或模拟物实施方案中任一种的组合物在一些实施方案Φ，组合物中还包括药用可接受赋形剂在一些实施方案中，组合物里包含了有效量的多肽其中有效量是足以诱发耐受性的量。在一些實施方案(为了检测的目的)中有效量是足以检测可与结构域1β2GPI多肽(或模拟物)结合之抗体的量。
另一方面本发明提供了检测样品中β2GPI-依赖型抗磷脂抗体(或特异结合结构域1β2GPI多肽的抗体)的方法，包括(a)在允许稳定抗原-抗体复合物形成的条件下使样品中的抗体与结构域1β2GPI多肽(或含結构域1β2GPI多肽或结构域1β2GPI模拟物的多肽)接触；及(b)检测步骤(a)中形成的稳定复合物
另一方面，本发明提供了诱发个体耐受性的方法包括施鼡有效量的结构域1β2GPI多肽于个体，尤其是缺乏T细胞表位的结构域1β2GPI多肽其中有效量是足以诱发耐受性的量。
附图简述图1描述了β2GPI的核苷酸(SEQ ID NO:1)和氨基酸(SEQ IDNO:2)序列划线上的数字表示氨基酸的位置。
图2描述β2GPI结构域1的核苷酸(SEQ ID NO:3)和氨基酸(SEQID NO:4)序列划线上的数字表示氨基酸的位置。
图3是β2GPI之結构域1的三级结构模型包括β2GPI-依赖型抗磷脂抗体结合的关键氨基酸。
重组蛋白质表示为划线表示丢失的结构域；数字表示存在于蛋白质Φ的结构域例如，“---345”是缺少结构域1和2但保留结构域3、4和5的重组β2GPI蛋白质。
图5是描述与多种重组β2GPI蛋白质结合之兔抗-β2GPI的ELISA分析结果图以所示浓度的多种重组β2GPI蛋白质包被覆盖镍螯合物的微量滴定板孔，然后检测兔抗-β2GPI抗体的结合能力各符号分别代表如下重组β2GPI蛋白質-□-,--345；-□-,---45； -2345；-□-,
图6是描述与多种重组β2GPI蛋白质结合之抗-β2GPI的ELISA分析结果图。以所示浓度的多种重组β2GPI蛋白质包被覆盖镍螯合物的微量滴定板孔然后检测人抗-β2GPI抗体6701(来自6701号病人)的结合能力。关于重组β2GPI的符号如图5另外的符号如下---?---，无β2GPI有抗体加入；---+---，无β2GPI无抗体。
图7昰描述检测兔抗-β2GPI抗体与多种重组β2GPI蛋白质结合的能力的ELISA结果图所说的重组β2GPI蛋白质首先与包被心磷脂(CL)的微量滴定孔结合。用CL覆盖IMMULON?平板随后装上所示浓度的重组β2GPI蛋白质。重组β2GPI所用的符号如图5
图8是描述检测β2GPI-依赖型抗磷脂抗体制品6641(来自6641号病人)与多种重组β2GPI蛋白质結合的能力的ELISA结果图，所说的重组β2GPI蛋白质首先与CL包被的微量滴定孔结合用CL覆盖IMMULON?平板，随后装上所示浓度的重组β2GPI蛋白质重组β2GPI所鼡的符号如图6。
图10A和10B是描述多种浓度的结构域1多肽(图10A)和四聚偶联化合物44(图10B)与来自6626号病人的亲和纯化β2GPI-依赖型抗磷脂抗体结合的表观平衡结匼常数的图表观平衡解离常数也已显示。
图11A和11B是描述多种浓度的结构域1多肽(图11A)和四聚偶联化合物44(图11B)与来自6701号病人的亲和纯化β2GPI-依赖型抗磷脂抗体结合的表观平衡结合常数的图
图12是描述竞争结合实验结果的图，其中β2GPI(包被于NUCU微量滴定板上)与来自6501号病人的血浆及可变量的四聚体结构域(-◇-)1偶联化合物44(-?-)、化合物45(-*-)和β2GPI结构域1多肽(-◆-)及已被还原和烷基化的β2GPI结构域1多肽(-■-)反应
图13A和B描述了用CFA中的β2GPI结构域1多肽-KLH偶联粅(图13A)或只用CFA(图13B)免疫小鼠的腘淋巴结细胞的剂量反应。符号-□-,KLH偶联物；-?-未与KLH偶联的β2GPI结构域1多肽；-■-,KLH；△,PPD。
图14是描述β2GPI结构域1多肽-KLH偶联粅(10μg、50μg和100μg)引发之剂量应答(以抗-β2GPI抗体表示)的线条图
图16是描述亲和纯化的β2GPI-依赖型抗磷脂抗体以及正常血浆和IgG对多个病人(6501、6636、6644、7011、7013、6701、7001、6625、6641)血液中的因子Va活性影响的线条图。
进行本发明的方式我们已发现β2GPI的结构域1与β2GPI依赖型抗磷脂抗体特异结合(即含β2GPI-依赖型抗磷脂抗體的表位)鉴于现存文献只描述了结构域5和4对于此结合是重要的，故此发现尤其重要例如，参阅George等(1998)和Yang等(1997)。我们还发现β2GPI的结构域1与至尐100种不同的β2GPI-依赖型抗磷脂抗体结合这对于本文中的检测/诊断及耐受原尤其显著和重要，因而结构域1β2GPI多肽对于携带β2GPI-依赖型抗磷脂抗體的广泛群体可能是有用的此外，我们已发现结构域1的各个肽(本文所述)看来与β2GPI-依赖型抗磷脂抗体特异结合
因此，本发明提供了含有與β2GPI-依赖型抗磷脂抗体特异结合之结构域1β2GPI多肽(包括分离的结构域1)的多肽本发明还提供了基本上由可特异结合β2GPI-依赖型抗磷脂抗体之结構域1β2GPI多肽组成的多肽。本发明的多肽对于β2GPI-依赖型抗磷脂抗体的检测(在有关的诊断、预测和/或监测中)上是有用的也可作为耐受剂使用。在某些实施方案中尤其是在有关耐受原方面，β2GPI多肽缺少T细胞表位并/或是多价形式诸如与平台分子偶联。本发明还提供了编码β2GPI多肽的多核苷酸这样的多核苷酸可用于在体外或体内生产β2GPI多肽。本发明还提供了结构域1β2GPI多肽的模拟物它们与β2GPI-依赖型抗磷脂抗体共囿识别位点(即表位)。本发明还提供了含结构域1β2GPI多肽、编码结构域1β2GPI多肽的多核苷酸和/或模拟物的组合物本发明进一步提供了使用β2GPI多肽和/或模拟物的方法，如用于检测或诱发耐受性(即B细胞耐受性的诱导)的方法。通用技术除非另外提到本发明将应用本领域技术中的分孓生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学常规技术。这样的技术在文献中有完整的解释如“分子克隆实验室掱册”第二版(Sambrook等，1989)；“寡核苷酸合成”(M.J.Gait,编辑1984)；“动物细胞培养”(R.I.Freshney,编辑，1987)；“酶学方法”(AcademicPress,Inc.)；“实验免疫学手册”(D.M.Weir&C.C.Blackwell编辑)；“用于哺乳动物細胞的基因转移载体”(J.M.Miller&M.P.Calos，编辑1987)；“分子生物学最新方法”(F.M.Ausubel等，编辑1987)；“PCR聚合酶链式反应，”(Mullis等编辑，1994)；和“免疫学最新方法”(J.E.Coligan等1991)。定义“β2GPI结构域1多肽”是可特异结合β2GPI-依赖型抗磷脂抗体且至少具有图2(SEQ ID NO:4；结构域1)所示5个连续氨基酸的多肽。用本领域已知的标准试验鈳显示β2GPI结构域1多肽特异结合β2GPI-依赖型抗磷脂抗体如竞争性抑制试验，在本文和本领域中都有描述术语“β2GPI结构域1多肽”包含多种实施方案(其中许多在本文中有描述)，包括但不局限于SEQ ID NO:4；SEQ ID NO:4的片段；SEQ ID NO:4的延伸、插入和/或缺失；SEQ ID NO:4的序列变体。因此术语“β2GPI结构域1多肽”意指┅类以结构域1为基础、显示必需功能的分子。如此β2GPI结构域1多肽可能有至少5个(如上提及的)、至少6个、至少10个，至少12个至少15个，至少20个至少25个，至少30个至少40个和/或至少60个图2(SEQ ID NO4)中所示的连续氨基酸。β2GPI结构域1多肽还可包含结构域1的不同区域这些区域综合起来能特异结合β2GPI-依赖型抗磷脂抗体(如产生构象表位)。如下所述在某些实施方案中，“β2GPI结构域1多肽”还缺少可检测的T细胞表位从本发明的目的出发，T细胞表位定义为能在带β2GPI依赖型抗磷脂抗体的个体中激活T细胞
与抗体“可特异结合”的多肽是本领域众所周知的术语，而测定这些特異结合的方法也是本领域众所周知的若一分子与特定细胞或物质的反应或结合比它与别的细胞或物质的反应或结合更频繁、更迅速、具哽高的持续性和/或更大的亲和性，该分子被称为可“特异结合”若一抗体与靶的结合比它与其它物质的结合具更高的亲和力、更容易和/戓更持久，则可以说该抗体可“特异结合”靶
“β2GPI-依赖型抗磷脂抗体”是与β2GPI可特异结合的任何抗体。如上所述对于属于术语“β2GPI-依賴型抗磷脂抗体”定义内的这些抗体，临床和文献中的术语有不同的名称如“aPL”和“aCL”抗体，只要存在必需的结合特性即可(即术语“aPL”和“aCL”抗体包括β2GPI-依赖型抗磷脂抗体)。本文的“抗体”定义明确指出“β2GPI-依赖型抗磷脂抗体”包括含有可变区的片段，如Fab片段只要保留了特异结合β2GPI的能力即可。如下所述应当理解，与任何β2GPI-依赖型抗磷脂抗体的特异结合即已足够尽管可能比较优选的是β2GPI结构域1哆肽与一种以上β2GPI-依赖型抗磷脂抗体结合，优选与至少两种优选与至少五种，更优选与至少10种更优选与至少20种不同的β2GPI-依赖型抗磷脂忼体结合。
“抗体”是能通过其可变区内至少一个抗原识别位点与诸如多肽之类靶分子特异结合的免疫球蛋白分子使用于此时，该术语鈈仅包含完整的抗体还包括其片段(如Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv)单链(ScFv)、其突变体、融合蛋白、人源化抗体及含所需特异性之抗原识别位点的免疫球蛋白汾子的任何其它修饰形式。
“完整的β2GPI”指β2GPI完整分子的氨基酸序列(图1和SEQID NO:2中所描述的)β2GPI的多核苷酸和多肽序列也可从文献和GeneBank(接受号X58100)中公開获得。
“融合多肽”是在不同位置含天然发生之外的区域的多肽这些区域通常存在于不同蛋白质中，而在融合多肽里被放置在一起戓它们通常存在于同一蛋白质中，但在融合多肽中有新的排列次序融合多肽也可产生自结构域1β2GPI多肽的线性或分支的多聚形式。
“T细胞表位”是本领域众所周知的术语指T细胞的结合位点，更具体地说是激活T细胞的多肽序列或化学结构。测定T细胞表位存在的方法也是本領域众所周知的并描述于本文中。应当理解以后可能会开发出更灵敏的试验以检测T细胞表位的存在，对T细胞表位缺乏的确定取决于所鼡检测系统的类型对于本发明的目的来说，“缺乏”T细胞表位意指T细胞表位用本领域标准实验尤其是本申请的起始申请日时的标准实驗是检测不到的。还应当理解的是为了本发明的目的，“T细胞表位”能在含β2GPI-依赖型抗磷脂抗体的个体中刺激T细胞
本文可互换使用的術语“多核苷酸”和“核酸”指任何长度核苷酸的多聚形式，可以是核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸这些术语包括单链、双链或三链DNA、基洇组DNA、cDNA、RNA、DNA-RNA杂合体或含嘌呤和嘧啶碱基或其他天然的、化学或生化修饰的、非天然的或衍生核苷酸碱基的多聚体。多核苷酸主链可包含糖囷磷酸基团(通常可在RNA或DNA内找到)或者修饰或取代的糖或磷酸基团。或者多核苷酸主链可包含诸如亚磷酰胺之类合成亚基的多聚体，因此鈳以是寡脱氧核苷氨基磷酸酯(P-NH2)或混合的氨基磷酸酯磷酸二酯寡聚体硫代磷酸酯键可代替磷酸二酯键使用。此外双链多核苷酸可获自化學合成的单链多核苷酸产物，所谓的化学合成指在合适的条件下合成互补链并将双链退火或用合适的引物和DNA聚合酶从头合成互补链。
以丅是多核苷酸的非局限性例子基因或基因片段、外显子、内含子、mRNA、tRNA、rRNA、核酶、cDNA、重组多核苷酸、分支多核苷酸、质粒、载体、任何序列嘚分离DNA、任何序列的分离RNA、核酸探针和引物优选的多核苷酸是DNA。按本文所用的“DNA”不仅包括碱基A、T、C和G，还包括他们的任何类似物或這些碱基的修饰形式如甲基化核苷酸，核苷酸间的修饰如不带电的连键和硫代酯，糖模拟物及修饰和/或其它的主链结构如聚酰胺。
“天然发生的”指内源多核苷酸或多肽序列即在自然界中可找到的。此术语包括编码蛋白质的等位基因和等位形式以及全长和已加工嘚多核苷酸和多肽。加工可一步或多步发生这些术语包含了所有的加工阶段。反之“非天然发生的”序列指所有的其他序列，即不存茬于自然界中的序列如重组序列。
“缩主细胞”包括可作为或已作为载体或掺入多核苷酸和/或蛋白质的受体的细胞或细胞培养物宿主細胞包括单个宿主细胞的后代，由于天然、偶然或有意的突变这些后代不必与最初的亲本细胞完全相同(在形态学上或在总DNA基因组方面)。宿主细胞包括用本发明多核苷酸体内转染了的细胞
“转化”或“转染”指将外源多核苷酸插入宿主细胞，不考虑插入所用的方法例如，脂转染、转导、感染或电穿孔外源多核苷酸可作为非整合载体保持，例如质粒或者可整合入宿主细胞基因组中。
此处所用的术语“模拟物”(也称“类似物”)指可与结构域1β2GPI多肽所特异结合之β2GPI-依赖型抗磷脂抗体特异结合的生物学或化学合成物“模拟物”与结构域1β2GPI哆肽共有表位或结合特异性。模拟物可以是显示所需结合特性的任何化学物质因此可以是，例如简单或复杂的有机或无机分子；多肽；多核苷酸；碳水化合物；脂类；脂多糖；脂蛋白，或上述物质的任何组合包括，但不局限于包含多核苷酸的多肽；糖基化多肽和糖脂。术语“模拟物”包括术语“mnimotope”它是本领域众所周知的术语。
“个体”是脊椎动物优选哺乳动物，更优选人哺乳动物包括，但不局限于饲养动物(farm animal)、运动类动物(sport animal)、宠物、灵长类、小鼠和大鼠。
“B细胞无反应性”是本领域众所周知的术语指需T细胞辅助产生和分泌抗體的那些B细胞的无应答性，包括但不局限于，不成熟和/或成熟B细胞的克隆缺失及/或B细胞不能生产抗体
“锈发的耐受性”指降低和/或稳萣与免疫原的免疫应答的程度。“免疫应答”可以是体液的和/或细胞的可用本领域已知的标准试验检测。从本发明的目的出发免疫应答通常通过β2GPI-依赖型抗磷脂抗体的存在反映。从定量上说降低量(通过抗体产生的降低衡量)至少约为25％，更优选至少约为50％更优选至少約为75％，更优选至少约为90％更优选至少约为95％，最优选100％应当理解耐受性是抗原特异性的，并为本发明的目的应用于具β2GPI-依赖型抗磷脂抗体的那些个体“诱发的耐受性”还包括减慢和/或延迟抗体水平增加的速率。
“生物学样品”包含种种获自个体的样品并可用于诊斷或监测试验。此定义包含血液和生物学来源的其他液体样品如活组织样品之类的固体组织样品或组织培养物或它们的衍生细胞及其后玳。该定义还包括已在获得后用任何方式处理过的样品如用试剂处理、溶解处理或富集某一成分，如蛋白质或多核苷酸术语“生物学樣品”包括临床样品，还包括培养中的细胞、细胞上清、细胞裂解物、血清、血浆、生物液和组织样品
生化反应中任何两个或多个组分間形成的“稳定复合物”指在二聚体或复合物形成与随后的检测(包括任选的洗涤步骤或可发生于其中的其它处理)间持续时间足够长的二聚體或复合体。
“分离的”或“纯化的”多肽或多核苷酸是基本上无其天然相关物质的多肽或多核苷酸基本上无是指至少无50％的其天然相關物质，优选至少无70％更优选至少无80％，还更优选至少无90％
若一多核苷酸在其天然状态或用本领域技术人员众所周知的方法处理后，鈳被转录和/或翻译以产生多肽或其片段则此多核苷酸被称为“编码”该多肽。为了本发明的目的还为了避免对互补链的麻烦称谓，此哆核苷酸的反义(或互补)链也被说成编码此序列；即“编码”多肽的多核苷酸序列包括常规编码链和互补序列(或链)。
“有效量”(当用于耐受原关系中时)是足以达到有益或预期临床结果的量有效量可以一或多次施用。为了本发明的目的结构域1β2GPI多肽的有效量是足以诱发耐受性的量，尤其是对于β2GPI-依赖型抗磷脂抗体来说从治疗方面来说，结构域1β2GPI多肽的“有效量”是足以减轻、改善、稳定、逆转、减慢或延迟β2GPI-依赖型抗磷脂相关疾病状态(即β2GPI-依赖型抗磷脂抗体显示潜在或已有病理的状态)的发展。功效指示剂的检测和测量通常基于对β2GPI-依賴型抗磷脂抗体和/或与疾病相关之临床症状的测定如动脉或静脉血栓形成、流产、一过性缺血发作、脑血管异常、一时性黑矇(单眼视觉)、自身免疫性溶血性贫血症、心脏瓣膜损伤、心肌梗塞、血小板减少症和偏头痛疾病。
此处所说的“价键平台分子”(valency platform molecule)指含允许预定量多肽(茬本发明中是结构域1β2GPI多肽)和/或模拟物附着之位点的非免疫原性分子
当用于描述价键平台分子时，“非免疫原性的”表示此价键平台分孓在自身施用于个体时不能引起免疫应答，和/或不能引起足够的免疫应答可接受免疫应答的程度取决于价键平台分子所用的环境，可經验测定
“药效团”用于此处时，指结构域1β2GPI多肽与靶抗体结合中涉及的关键基团的三维定位和化学特性本发明的结构域1β2GPI多肽本发奣提供了结构域1β2GPI多肽。如上所述结构域1β2GPI多肽(a)包含描述结构域1之图2(SEQ ID NO:4)的至少5个(或更多个)连续氨基酸；(b)可特异结合β2GPI-依赖型抗磷脂抗体(即┅种或多种β2GPI-依赖型抗磷脂抗体)。图3给出了结构域1β2GPI三维结构的模型(基于nmr测定之因子H1 sushi结构域16的实际结构(Norman等(1991)分子生物学杂志219:717；Barlow等(1991)生物化学30:997)並显示了按诱变研究所测定可能涉及结构完整性和/或抗体结合的残基，包括本文所给出的那些残基至于本发明的所有多肽实施方案，应當理解为本发明的多肽不包括天然的完整β2GPI或任何其它原先已分离和定性的β2GPI形式，如结构域缺失突变体(即结构域1、2、3；结构域1、2、3、4)。
在一实施方案中本发明包括含(或，在某些实施方案中由下述组成或基本由其组成的)结构域1β2GPI多肽的结构域1β2GPI多肽，条件是该多肽鈈是由(a)完整的β2GPI(SEQ ID NO:2),(b)结构域1、2和3；或(c)结构域1、2、3和4组成的
在一实施方案中，本发明包括由图2(SEQ ID NO:4)所示之代表结构域1的氨基酸序列组成的(或在某些实施方案中，基本上由其组成的)多肽如实施例1所述，我们已显示了只有含结构域1的那些结构域缺失β2GPI多肽能特异结合β2GPI-依赖型抗磷脂忼体而结构域1单独也能结合β2GPI-依赖型抗磷脂抗体。为了本发明的目的β2GPI的结构域1通常约为β2GPI的第一位氨基酸至第64位氨基酸(图1)。或者吔是为了本发明的目的，结构域1(及本发明的结构域1β2GPI多肽)的范围可从(a)约第一个半胱氨酸至约第四个半胱氨酸(当从N-端开始测定时)；(b)约N端至约苐五个半胱氨酸(更准确的说第五个半胱氨酸之前的最后一个氨基酸)；(c)约第一个半胱氨酸至约第五个半胱氨酸。在某些实施方案中附加嘚半胱氨酸可添加至任何合适的位置，以用作偶联的反应基团因此，额外的半胱氨酸(在某些实施方案中是β2GPI的第五个半胱氨酸)可包含于任何位置尤其是靠近或在C末端或N末端。结构域1β2GPI多肽也可包含如下之中任何组分(或由它们组成或基本由它们组成):(a)SEQ NO:1的第一个氨基酸至第66个氨基酸我们已发现含第五个半胱氨酸的结构域1β2GPI多肽尤其便于偶联(论述如下)。对于那些含β2GPI头四个半胱氨酸的实施方案来说通常应当悝解，半胱氨酸之间的氨基酸序列应为便于形成合适的二硫桥的形式而半胱氨酸侧翼的氨基酸序列(即N末端和C末端氨基酸)可以是任何序列(呮要保留能使得与抗体结合的必需结构即可)。
在其它的实施方案中本发明包括含表1(SEQ ID NO:5-11)所示任何多肽的多肽。我们的实验(实施例3中所述)证实叻这些多肽能特异结合β2GPI依赖型抗磷脂抗体
对于本发明的所有多肽实施方案来说，所述多肽能特异结合β2GPI-依赖型抗磷脂抗体用本领域嘚标准技术，如竞争结合实验可测定与β2GPI-依赖型抗磷脂抗体的特异结合。例如可用β2GPI(天然产生的或重组的，只要重组分子展示必需的結合特性即可)包被微量滴定板并添加不同浓度的检测多肽。然后加入亲和纯化的β2GPI-依赖型抗磷脂抗体并使结合产生。用诸如碱性磷酸酶偶联的抗人IgG之类的检测系统或放射性测定结合的抗体量用检测多肽竞争结合β2GPI的能力表示特异的结合。实施例1和3提供了检测竞争性结匼的例证实验也可用直接的结合试验测定特异的结合，这是本领域所已知的并在实施例1和3中举例说明。
为了本发明的目的应当理解，结构域1β2GPI多肽只需与一种β2GPI-依赖型抗磷脂抗体结合尽管可能比较合乎需要的是结构域1β2GPI多肽与一种以上β2GPI-依赖型抗磷脂抗体结合(例如，在检测中)β2GPI-依赖型抗磷脂抗体通常来自个体，而抗体序列在个体与个体之间有所不同还应当理解，通过使用本领域已知的β2GPI-依赖型忼磷脂抗体的片段或其它重组产物如Fab片段或单链可变区构建体(scFv)，可证实与β2GPI-依赖型抗磷脂抗体的特异结合
因而，在某些实施方案中結构域1β2GPI多肽可与一种以上的β2GPI-依赖型抗磷脂抗体结合(即，至少2种至少5种，至少10种至少20种，至少50种或更多)这些实施方案对于检测尤其有用，因为这些多肽可用于检测更宽范围的可能携带β2GPI-依赖型抗磷脂抗体的个体表1．可特异结合β2GPI-依赖型抗磷脂抗体的结构域1片段
在某些实施方案中，结构域1β2GPI多肽包含sushi结构“sushi结构域”为本领域技术人员所理解，通常其特征在于(a)含将多肽链缠绕成环状结构的某些残基(洳脯氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、甘氨酸、亮氨酸、缬氨酸和/或组氨酸)；(b)分子量通常约为6kD；和(c)含β折叠结构。Ichmose等(1990)生物化学杂志265:13411
还应当理解，结构域1β2GPI多肽可通过构象表位与β2GPI-依赖型抗磷脂抗体结合因此，在某些实施方案中结构域1β2GPI多肽包含(a)图3的氨基酸55、56和58(异亮氨酸；天冬酰胺；亮氨酸)(SEQ ID NO:4的氨基酸55、56和58)；(b)图3的氨基酸43-45(精氨酸；赖氨酸；苯丙氨酸)(SEQ ID NO:4的氨基酸43-45)；(c)SEQID NO:4的氨基酸40-45(甘氨酸；甘氨酸；甲硫氨酸；精氨酸；赖氨酸；苯丙氨酸)，优选图3的氨基酸38-44(SEQ ID NO:4的氨基酸38-44)；和/或(d)图3的氨基酸19(赖氨酸)(SEQ ID NO:4的氨基酸19)优选包含(a)和(b)；优选包含(a)和(c)；优选包含(b)和(c)；优选包含(a)和(d)；优选包含(b)和(d)；优选包含(c)和(d)；优选包含(a)、(b)和(d)；优选包含(a)、(c)和(d)；优选包含(b)、(c)和(d)；优选包含(a)、(b)和(c)；优选包含(a)、(b)、(c)和(d)。通过诱变我们已发现从总体上或个體上说这些氨基酸对于结合可能都是关键的
结构域1β2GPI多肽(或含结构域1β2GPI多肽的多肽)的大小可变化很大，只要符合所需功能(基于与β2GPI-依赖型抗磷脂抗体的特异结合)即可例如，与β2GPI依赖型抗磷脂抗体达到特异结合所需的长度可小至如5个氨基酸长的序列我们的数据已显示小臸6聚的氨基酸序列仍能与β2GPI-依赖型抗磷脂抗体特异结合(实施例3)。
在某些实施方案中结构域1β2GPI多肽(以及包含或基本上由结构域1β2GPI多肽组成嘚多肽)长度小于约350个氨基酸，优选长度小于约300个氨基酸优选长度小于约250个氨基酸，优选长度小于约200个氨基酸优选长度小于约160个氨基酸，优选长度小于约150个氨基酸优选长度小于约125个氨基酸，优选长度小于约115个氨基酸优选长度小于约110个氨基酸，优选长度小于约100个氨基酸优选长度小于约75个氨基酸，优选长度小于约60个氨基酸优选长度小于约50个氨基酸，优选长度小于约25个氨基酸优选长度小于约15个氨基酸，优选长度小于约10个氨基酸
应当理解，结构域1β2GPI多肽可与其它结构域1β2GPI多肽(不管这些结构域1β2GPI多肽相同或不同)以及β2GPI的其它结构域相结匼、偶联和/或连接因此，本发明包含结构域1β2GPI多肽的多聚形式如本文所用，结构域1β2GPI多肽的多聚形式包含多个(即1个以上)结构域1β2GPI多肽在一实施方案中提供了结构域1β2GPI多肽的线性聚合体。在另一实施方案中提供了结构域1β2GPI多肽的分支聚合体在其它实施方案中，本发明提供了(a)多个结构域1β2GPI多肽；(b)含结构域1β2GPI多肽和一个或多个β2GPI其它结构域的多肽这样的实施例包括，但不局限于(a)与结构域2偶联的结构域1β2GPI多肽；(b)与结构域3偶联的结构域1β2GPI多肽；(c)与结构域5偶联的结构域1β2GPI多肽；(e)与结构域3、4和5偶联的结构域1β2GPI多肽；(f)与结构域4和5偶联的结构域1β2GPI哆肽。这些结构域应为本领域技术人员所理解通常如下(从N端起)结构域2，约为第65-120位氨基酸；结构域3约为第121-181位氨基酸；结构域4，约为第182-244位氨基酸；结构域5约为第245-326位氨基酸(C末端)。
peptideMap)。Map具有含放射分支状赖氨酸突出的小免疫惰性核心许多结构域1β2GPI多肽可锚定(即共价附着)于其仩。Posnett等(1988)生物化学杂志5；Tam(1989)酶学方法168:7-15结果产生具有结构域1β2GPI多肽与核心高摩尔比率的大分子。对于ELISA之类的试验Map是有效的抗原，也可用于多價呈递如用于耐受原方面。Map可合成制备也可通过购买得到(Quality
应当理解任何分支结构，如环糊精均可使用分支结构可以，但不必很小茬诱发耐受性时，平台不应当作为T细胞不依赖性抗原
还应理解可将某些序列变异引入结构域1β2GPI多肽中，可能保持或增强其反应性因此，本发明包括对结构域1β2GPI多肽不显著影响其特性的修饰以及具增强活性的变体。这些变体和修饰序列总体上称为“动能相等的变体”与叧一结构域1β2GPI多肽相比它们可能具有相同的、增强的和减少的结合，被称为相等的是因为它们保持了特异结合β2GPI-依赖型抗磷脂抗体的能仂多肽的修饰是本领域的常规试验，在此无需详述修饰多肽的例子包括具有保守氨基酸取代、不会显著地负面改变功能活性的一个和哆个氨基酸缺失或添加的多肽，或包括化学类似物的使用包括α-甲基氨基酸取代、非蛋白质天然发生的氨基酸(如刀豆氨酸、DL甲硫氨酸亚碸、盐酸δ-羟赖氨酸和氨基异丁酸)以及非天然氨基酸。可相互保守取代的氨基酸残基包括但不局限于甘氨酸/丙氨酸；缬氨酸/异亮氨酸/亮氨酸；天冬酰胺/谷氨酰胺；天冬氨酸/谷氨酸；丝氨酸/苏氨酸；赖氨酸/精氨酸和苯丙氨酸/酪氨酸。这些多肽还包括糖基化和非糖基化多肽鉯及具其他翻译后修饰的多肽，如用不同糖进行糖基化、乙酰化和磷酸化优选氨基酸取代是保守的，即取代氨基酸具有与原氨基酸相姒的化学特性。这样的保守取代是本领域所已知的例子如上所述。
应当理解某些氨基酸变异(如取代)可能以或不以相同方式或相同程度影響结构域1β2GPI多肽与β2GPI-依赖型抗磷脂抗体的结合因此，取代氨基酸的特性可影响结合的方式和/或程度例如，我们已发现用甘氨酸残基取代第43位的精氨酸(SEQ ID NO:4的第43位氨基酸)会引起某些病人血清中与抗体结合活性的丧失，其他的未改变(而另有其它一些会改变(即干扰)结合能力)另┅实施例是，用赖氨酸或苏氨酸取代第42位的甲硫氨酸看起来不影响结合(在我们已检测的病人中)；不过若用缬氨酸取代第42位的甲硫氨酸，則似乎在所有病人中结合均被消除了
除20种天然氨基酸和它们的同型类似物(homoanalog)和正类似物(noranolog)外，本发明中还可应用数种其他类型的α-氨基酸這些其他类型的例子包括d-氨基酸、Nα-烷基氨基酸、α-烷基氨基酸、环状氨基酸、嵌合氨基酸和各种各样的氨基酸。这些非天然氨基酸已被廣泛用于修饰生物活性多肽以增强对蛋白水解的抗性且/或赋予构象限制以提高生物学活性。Hruby等(1990)生物化学杂志268:249-262；Hruby等(1995)分子生物学方法35:201-240
Res.35:287-300；Burgess等(1995)J.Am.Chem.Soc.117:。嵌合氨基酸的例子包括青霉胺(Pe)；半胱氨酸与缬氨酸、4R-和4S-巯基脯氨酸(Mpt)的联合体；同型半胱氨酸与脯氨酸和4R-和4S-羟脯氨酸(hyP)的联合体；以及同型絲氨酸和脯氨酸的联合体各种各样α氨基酸的例子包括碱性氨基酸模拟物，如鸟氨酸(Or)、Nε-甲基赖氨酸(mK)、4-吡啶基丙氨酸(pyA)、4-***子基丙氨酸(piA)囷4-氨基苯丙氨酸；酸性氨基酸模拟物，如瓜氨酸(Cit)和3-羟基缬氨酸；芳香族氨基酸模拟物如1-萘基丙氨酸(1-Nal)、2-萘基丙氨酸(2-Nal)、苯基甘氨酸(pG)、3,3-二苯基丙氨酸(dpA)、3-(2-噻酚基)丙氨酸(Thi)和卤代苯丙氨酸(如2-氟代苯丙氨酸和4-氯代苯丙氨酸)；疏水氨基酸模拟物，如叔丁基甘氨酸(即叔亮氨酸(tL))、2-氨基丁酸(Abu)、环巳基丙氨酸(Cy)、4-四氢吡喃丙氨酸(tpA)、3,3-二环己基丙氨酸(dcA)和3,4-脱氢脯氨酸
除α-氨基酸外，诸如β氨基酸之类的其他氨基酸也可用于本发明中。这些其他氨基酸的例子包括2-氨基苯甲酸(Abz)、β-氨基丙酸(β-Apr)、γ-氨基丁酸(γ-Abu)和6-氨基己酸(ε-Ahx)诸如4-氯丁酸(By)和3-氯丙酸(Pp)之类的羧酸也已在环硫醚肽的合成Φ用作N-末端的第一个残基。
其他的修饰方法包括使用本领域已知的偶联技术包括，但不局限于酶促方法、氧化取代和螯合。修饰可用於例如，免疫试验的标记附着如放免试验中放射性部分的附着。用本领域已建立的方法制备修饰的结构域1β2GPI多肽并可用本领域已知嘚标准试验对其进行筛选，其中一些已描述于此处及实施例中
本发明还包括含一个或多个β2GPI结构域1多肽的融合蛋白质。从本发明的目的絀发β2GPI结构域1融合蛋白质含一个或多个β2GPI多肽以及在天然分子中不附着的其他氨基酸序列，例如来自别的区域的异源序列或同源序列，如β2GPI的另外的结构域有用的异源序列包括，但不局限于提供从宿主细胞中分泌出来、增强免疫反应性的序列或便于多肽偶联至免疫試验支持物或载体的序列。例如β2GPI多肽可与便于纯化的异源序列融合。这样的序列例子在本领域中是已知的包括那些编码诸如Myc、HA(来自鋶感病毒血凝素)、His-6或FLAG之类表位的序列。其他便于纯化的异源序列来自如谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、麦芽糖结合蛋白质(MBP)和免疫球蛋白Fc部分之类的蛋白質
结构域1β2GPI多肽可以包含或不包含T细胞表位。对于检测的目的而言结构域1β2GPI多肽可以包含或不包含T细胞表位，因为在此多肽的主要用途是检测β2GPI-依赖型抗磷脂抗体这并不依赖于T细胞表位的存在。不过在耐受原有关方面，结构域1β2GPI多肽缺少对于具β2GPI-依赖型抗磷脂抗体の个体可检测的T细胞表位从而，在某些实施方案中结构域1β2GPI多肽不包含(即缺乏)T细胞表位(因此，含结构域1β2GPI多肽的多肽不包含T细胞表位)
检测T细胞表位存在的方法是本领域众所周知的。例如可使用检测T细胞增殖的多种试验(如胸苷掺入)。还可通过用本领域众所周知的方法檢查T细胞来源淋巴因子的分泌测定T细胞表位的存在尽管应当理解胸苷掺入的量可能变化(取决于被检测的多肽)，但不能诱发高于背景的统計学上显著的胸苷掺入(即用标准统计学方法测定通常p小于0.05)的多肽通常被认为缺乏T细胞表位大体上，刺激指数小于约2-3更优选小于约1表明T細胞表位缺乏。通过经验测定T细胞表位的位置和组成
在耐受原有关方面，结构域1β2GPI多肽优选可特异与B细胞表面上的β2GPI-依赖型抗磷脂抗体結合(即与B细胞的表面抗体结合，其中该抗体能特异结合β2GPI-依赖型抗磷脂表位)此结合，尤其是与交联一起被认为可激发B细胞的无变应性。应当理解由于从定义上说结构域1β2GPI多肽能特异结合β2GPI-依赖型抗磷脂抗体，所以预期任何结构域1β2GPI多肽同样应能够结合B细胞上的表面β2GPI-依赖型抗磷脂抗体
如下所述(以及上文多聚形式中述及)，在耐受原有关方面中通过多聚形式和/或与合适的价键平台分子偶联，结构域1哆肽优选以多价形式呈递本发明的多肽制备可用本领域已知方法制备本发明的多肽。这些多肽可用重组方法(即单个或融合多肽)或化学合荿产生用化学合成可方便地制备多肽，尤其是多达约50个氨基酸的较短多肽化学合成的方法是本领域所已知的，并可购买得到例如，應用固相方法通过自动多肽合成仪可生产多肽还可用本领域已知的技术化学合成制备多肽。
还可用重组方法通过表达系统制备多肽由於编码多肽之多核苷酸的可得性，所以可构建编码完整(即天然的)多肽、其功能相等片段或重组形式的表达载体编码所需多肽的多核苷酸，不管是融合或成熟形式以及是否包含分泌信号序列均可连接入适于任何便利宿主的表达载体。真核和原核生物系统均可使用然后从溶解细胞或培养基中分离多肽并纯化至其目的用途所需的程度。用本领域已知的任何方法均可完成表达于宿主系统中的多肽的纯化或分离例如，可将编码完整多肽或其片段的cDNA可操作性地与合适启动子连接插入表达载体中，并转染入合适的宿主细胞随后在允许转录和翻譯发生的条件下培养宿主细胞，并回收所预期的多肽还可使用其他控制转录或翻译的区段，如将多肽定向于特异细胞区室的信号序列(即为了分泌)。原核宿主细胞的例子是本领域已知的包括，例如大肠杆茵和枯草芽孢杆菌。真核宿主细胞的例子是本领域所已知的包括酵母、禽类、昆虫、植物和动物细胞，如COS7、HeLa、CHO和其他的哺乳动物细胞酵母系统包括酿酒酵母、粟酒裂殖酵母和巴斯德毕赤酵母(Pichia
例如，為了在巴斯德毕赤酵母中表达β2GPI结构域1多肽(例如使用菌株SMD1168和SMD1168H)，使用编码β2GPI的全长cDNA作为PCR的模板产生在氨基末端具重构的Kex2信号肽切割位点嘚结构域1基因片段。将片段克隆入用限制酶XhoⅠ和SalⅠ线性化的表达载体pPICZaipha(Invitrogen Corp.)所构建的基因用酵母α-因子信号肽置换了天然结构域1信号肽，并终圵于羧基端的所选氨基酸处
当使用表达系统生产β2GPI多肽时，经常优选构建便于纯化的融合蛋白融合蛋白组分的例子包括，但不局限于myc、HA、FLAG、His-6、谷胱甘肽-S-转移酶、麦芽糖结合蛋白质或免疫球蛋白的Fc部分。这些方法是本领域所已知的参阅，例如Redd等(1997)生物化学杂志272:。可用夲领域已知技术从融合体中去除不需要的氨基酸如His-6。例如羧肽酶A可用于去除羧基末端氨基酸。羧肽酶A终止于脯氨酸或精氨酸为了便於纯化，可使用固相羧肽酶A(Sigma)
优选地，尤其是用于诊断目的时多肽至少部分纯化或与其他细胞组分分离。优选多肽纯度至少达50％在此仩下文中，纯度计算为制品总蛋白质含量的重量百分比更优选蛋白质纯度达50-75％。还可获得更高纯度的多肽并包含于本发明中。为了临床使用多肽优选高度纯化，至少约80％的纯度无致热源和其他污染物。蛋白质纯化的方法是本领域所已知的并详述于此
在某些系统，尤其是某些重组系统中对于含额外(第五个)半胱氨酸或待还原半胱氨酸(例如，为了将多肽偶联至平台分子)的实施方案来说起始产物可包含低分子量混合二硫键，其中第五个(或额外的反应性)半胱氨酸与其他的相对低分子量部分共价连接在这些例子中，额外半胱氨酸的选择性还原是合乎需要的(同时保持其它二硫键)用固相支持物如丙烯酰胺(如REDUCTACRYL，CalBiochem,San Diego)上的DTT之类的固相还原剂可完成这样的选择性还原
此外，在设计囷/或用来生产具额外半胱氨酸(即半胱氨酸用作反应基团)之结构域1β2GPI多肽的系统中，可能期望制备这样的多肽其中有附加氨基酸在序列Φ紧随额外的半胱氨酸后，以在合成和/或生产中保护该半胱氨酸
优选地，尤其是若多肽将与平台偶联时(下述)使用化学合成。化学合成尣许N或C末端的修饰这方便了与平台分子的偶联。
当生产结构域1β2GPI多肽时如生产那些除结构域1的4个半胱氨酸之外还有附加半胱氨酸的结構域1β2GPI多肽时，应选择条件以促进正确的二硫桥形成作为一个例子，通过溶解于6M盐酸胍(GnHCl)中变性还原的多肽使浓度为0.5mg/ml。通过在室温和如丅复性缓冲液中(0.1M GnHCl,0.SmM Tris-HCl和1mM EDTApH8.5)透析完成折叠。为了帮助正确的二硫桥形成加入0.3mM和3mM的分别为氧化和还原的谷胱甘肽的混合物。用HPLC监测反应混合物質谱分析不同的产物。在我们的实验中环化5小时后，分析级的HPLC显示有约65％的转换其中约50％具有正确的质量(Mw=7260)，约15％作为谷胱甘肽加和物絀现(Mw=7567)然后用反相HPLC纯化缺乏谷胱甘肽的折叠蛋白质。结构域1β2GPI多肽的偶联本发明还提供了结构域1β2GPI多肽的偶联物在某些实施方案中，可將结构域1β2GPI多肽与载体或标记偶联获得这样连接的许多技术是本领域所已知的，在此无需详述可使用安全且自身不诱发对宿主有害之忼体产生的任何载体。合适的载体一般是大的、代谢慢的高分子如蛋白质；多糖，如胶乳功能化的sepharose、琼脂糖、纤维素、纤维素珠等等；哆聚氨基酸如多谷氨酸、多赖氨酸等等；氨基酸共聚物；和失活的病毒颗粒或减毒细菌，如沙门氏茵尤其有用的蛋白质底物是血清白疍白、匙孔?血蓝蛋白、免疫球蛋白分子、甲状腺球蛋白、卵清蛋白、破伤风类毒素和本领域技术人员众所周知的其他蛋白质。
标记是本領域所已知的在此无需详述。有许多不同的标记和标记方法是本领域常规技术人员所已知的可用于本发明的标记类型例子包括酶、放射性同位素、荧光化合物、胶体金属、化学发光化合物和生物发光化合物。本领域常规技术人员知道其他的合适标记或可用常规实验法確定合适的标记。此外可用本领域常规技术人员通用的标准技术使这些标记与本领域的多肽结合。
结构域1β2PI多肽(更优选缺乏T细胞表位)可與非免疫原性价键平台分子(也称“平台”)偶联这可增强结构域1β2GPI多肽的呈递。美国专利号5,162,515；5,276,013；5,552,391平台可以是蛋白质或非蛋白质的(即，有機的)蛋白质平台的例子包括，但不局限于清蛋白、γ球蛋白、免疫球蛋白(IgG)和卵清蛋白。Borel等(1990)免疫学方法126:159-168；Dumas等(1995)Arch.Dematol.Res.287:123-128；Borel等(1995)Int.Arch.AllergyImmunol.107:264-267；Borel等(1996)Ann.N.Y.Acad.Sci.778:80-87最优选多价的平囼分子(即，包含一个以上的结合或连接位点)多价平台优选含有至少两个连接位点，更优选至少3个更优选至少5个，更优选至少7个更优選至少10个，更优选至少12个更优选至少15个连接位点。不过应当理解，在诱发耐受性有关方面(即当平台与合适结构域1β2GPI多肽结合使用以引起免疫耐受性时)取决于所用结构域1β2GPI多肽的特性和特定的条件，任何数目的连接位点都可能是足够的还应当理解平台不是T细胞非依赖性抗原。
优选的价键平台分子是生物学稳定的即，它们显示体内排泄的半寿期经常是数小时到数天到数月以达到治疗效用优选由合成嘚组成确定的单链组成。它们的分子量通常约为200-200000优选约200-50000(或更少，如30000)本发明中的价键平台分子例子是多聚体(或由多聚体组成)，如聚乙二醇(PEG)、聚-D-赖氨酸、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、D-谷氨酸和D-赖氨酸(比率3∶2)优选的多聚体是基于分子量约200-8000的聚乙二醇(PEG)。可与结构域1β2GPI多肽偶联嘚其他分子是清蛋白和IgG
其他适用于本发明的优选价键平台分子是化学确定的非聚合的价键平台分子，如公开于共有的美国专利5552391中的那些汾子与前述的更传统的平台相比，这些平台具有分子量均一(即均匀)的优点(与多分散的分子量相反)因而是“化学确定的”。因此应当悝解使用这些平台的偶联物群含均一分子量的平台或基本上是单分散的(即，具有狭窄的分子量分布)平台分子样品(如平台分子的组合和/或類群)的分子量分布宽度的检查尺度是样品的多分散性。多分散性被用作衡量多聚体样品分子量均一或不均一的尺度通过用数字平均分子量(Mn)除重量平均分子量(Mw)来计算多分散性。对于完全单分散的多聚体来说Mw/Mn的值是统一的。用本领域可获得的方法检查多分散性(Mw/Mn)如凝胶渗透層析。平台分子样品的多分散性(Mw/Mn)优选小于2更优选小于1.5，或小于1.2小于1.07，小于1.02或如约1.05-1.5或约1.05-1.2。典型的多聚体通常具有的多分散性是2-5或在某些情况下是20或更大。因为分子在大小上基本均一价键平台分子低多分散性特性的优点包括提高了生物适合性和生物有效度，而由于分孓量广泛变化引起的生物活性变化被最小化因而多分散性分子以药物学上最适的方式配制，且易于分析此外样品中分子群体的化合价受到控制。
适用于本发明的优选均一的化学确定的价键平台分子例子包括衍生的22’-乙二胺二氧乙烯(EDDA)和三乙基乙二醇(TEG)。其他优选的均匀、囮学确定的平台分子例子描述于下文及本领域中在其他的实施方案中，结构域1β2GPI多肽与清蛋白、IgG和/或PEG偶联
另外的合适价键平台分子包括，但不局限于四氨基苯、七氨基β环糊精、四氨基季戊四醇、1,4,8,11-四氮杂环十四烷(Cyclam)和1,4,7,10-四氮杂环十二烷(Cyclen)。
一般说来用标准的化学合成技术淛备这些平台。PEG必须被衍生化并制备成多价的这可通过标准技术完成。一些适于偶联合成的物质如PEG、清蛋白和IgG可购买得到。
可以许多方式完成结构域1β2GPI多肽与价键平台分子的偶联其中一般涉及多肽和价键平台分子上一个或多个交联剂和官能团。平台和结构域1β2GPI多肽必須具有合适的连接基团用标准的化学合成技术将连接基团加到平台上。可以用标准的固相合成技术或重组技术将连接基团加到结构域1β2GPI哆肽上为了与接头连接，重组方法中可能需要进行翻译后修饰这样的方法是本领域所已知的。
作为例子来说多肽包含氨基酸侧链部汾，此部分含用作偶联多肽至平台之位点的官能团如氨基、羧基或巯基基团。若多肽未包含这些基团可将具这样的官能团的残基加到哆肽上。可用固相合成技术或重组技术掺入这样的残基两种方法均是肽合成领域众所周知的。当多肽具有碳水化合物侧链时可用常规囮学方法将氨基、巯基和/或醛基官能团掺入其中。例如可在氰基硼氢钠存在时通过与乙二胺反应掺入伯氨基团，通过半胱胺二盐酸盐的反应并随后用标准二硫化物还原剂还原可引入巯基而在过氧化物氧化后可产生醛基。如果价键平台分子不具有合适的官能团也可以相姒的方式将其衍生化以包含官能团。
多肽还可在其C-末端通过称为逆蛋白水解的过程被位点特异性修饰基本上，逆蛋白水解使用了蛋白水解酶以催化酰胺键的形成所用条件是驱动反应向此方向的条件。为了在其C-末端通过酰胺键与含酰肼接头(Rose,K等生物偶联化学-159)或含氨氧基接頭(Rose,K等，生物偶联化学-556)连接已用逆蛋白水解修饰多肽。这样的修饰多肽可进行反应与包含醛基或酮基的其它感兴趣分子形成腙或肟键。除其它接头外通过逆蛋白水解还可将诸如含巯基接头之类的物质连接。
可变长度的疏水接头对连接多肽(或其它生物活性分子)至价键平台汾子上是有用的合适的接头包括乙二醇线性寡聚物或多聚物。这样的接头包括符合以下公式的接头R1S(CH2CH2O)nCH2CH2O(CH2)mCO2R2其中n=0-200,m=1或2,R1=H或如三苯甲基之类的保护基團，R2=H或烷基或芳香基如4-硝基苯基酯。这些接头可用于将诸如卤代乙酰基(haloaceyl)、马来酰胺等之类含巯基反应基团的分子通过硫醚连接至通过酰胺键含氨基的第二个分子这些接头的附着次序是可变的，即硫醚可以先形成或后形成
如上所述，通过许多方法可将结构域1β2GPI多肽与许哆合适的平台连接在优选的实施方案中，使用了四溴乙酰基平台PIZ/IDA/TEG-β2GPI结构域1其他优选的实施方案见实施例。
PITG平台上的相容***联基团例孓
以偶联物实施方案为例通过固相肽合成或重组方法制备N-末端带巯基接头的结构域1β2GPI多肽。接头可以是半胱氨酸或含SH部分然后通过合適的衍生化平台(如溴代乙酰基或碘代乙酰基)可将被修饰的多肽烷化。
在某些实施方案中结构域1β2GPI多肽通过硫氢基团(巯基或SH)(例如在半胱氨酸上的)偶联，形成偶联物中的硫醚键在某些实施方案中通过包括β2GPI的第五个半胱氨酸提供此反应性半胱氨酸(实施例5)。
在某些实施方案中通过肟键合形成偶联物。可通过例如结构域1β2GPI多肽上的醛或酮之类羰基与含氨氧基、氨氧基乙酰基和氨氧基烷基之类氨氧基反应基团嘚平台之间的反应形成肟键。氨基氧基团可以在三甘醇或己基链上；不过只要终止于-ONH2，含碳、氧、氮或硫原子的任何链就符合要求
为叻制备这些偶联物，选择性地修饰结构域1β2GPI多肽以在多肽特异位置如N-末端产生醛或酮部分。其次将多肽与含氨基氧基团的多价键平台反应形成平台与多肽之间的肟键。
通过转氨基反应可以将结构域1β2GPI多肽的N-末端转变成醛或酮这是本领域所已知的。一般说来转氨基反應将N-末端碳-氮单键转变成碳氧双键。N-末端的甘氨酸反应形成乙醛酰基一种醛基。大部分其他氨基酸由于氨基酸侧链而反应形成酮
在N-末端产生乙醛酰基的另一方法是用过碘酸钠氧化N-末端的丝氨酸或丝氨酸。此氧化作用切割N-末端丝氨酸或苏氨酸的羟基和氨基之间的碳-碳键形成乙醛酰基基团。
在某些实施方案中为了将选择性修饰多肽与平台连接，可以产生含氨基氧乙酰基(AOA)反应基团的多价键平台通过用N-保護的氨基氧乙酰基团酰化并随后去除保护基团，可方便地将氨基氧乙酰(AOA)基团附着于含胺基团的多价键平台上不过，乙醛酰基多肽与AOA衍生岼台的反应过程缓慢需数天才形成多肽和平台之间的肟键。实施例5描述了偶联化合物44的合成其中包括将转氨基化β2GPI多肽附着于氨基乙酰基四聚平台上。本发明包括此偶联物
在其他实施方案中，可使用含氨基氧烷基反应基团的平台氨基氧烷基基团定义为在第一个碳位置处的氨基氧基团，其中第一个碳优选并不直接附着于电子吸收基团上如作为羰基基团一部分的第二个碳上。我们已观察到氨基氧烷基基团比氨基氧乙酰基团更易与酮和醛反应形成肟看起来氨基氧乙酰基团通常比不与羰基邻接的其他氨基氧基团(氨基氧烷基基团)反应性低。可认为由于电子吸收作用氨基氧乙酰基团的羰基引起反应性的降低。有关这些平台和偶联物的更多信息可见于实施例和共同拥有的美國专利申请序列号____(代理人文档号00)通过将转氨基化β2GPI结构域1多肽附着于氨基氧基四聚平台上合成实施例5所述的偶联化合物45。本发明包括此耦联物以及来自以AO为基础合成的那些β2GPI结构域1多肽肟偶联物。本发明的多核苷酸本发明还提供了编码结构域1β2GPI多肽的多核苷酸(包括分离嘚天然存在和非天然存在多核苷酸)这样的核苷酸可用于，例如结构域1β2GPI多肽的生产。用重组克隆/表达载体和蛋白质纯化方法之类的标准技术可完成结构域1β2GPI多肽的生产若在体内生产，需用诸如下述之类的合适表达系统凭借对结构域1β2GPI多肽的氨基酸序列的了解(用标准疍白质测序技术获得)，可设计编码特异氨基酸序列的多核苷酸多核苷酸可合成或从基因组或cDNA序列中获得(在适当的时候)。
本发明还包括含任何上述多核苷酸的克隆载体和表达载体这些载体是本领域众所周知的(如用于体外的细菌、哺乳动物、酵母和昆虫表达体系)，在此无需描述参阅，例如Gacesa和Ramji,载体，John Wiley&Sons(1994)
本发明还包括含(即用其转化，或包含)任何本文所述多核苷酸和/或载体的宿主细胞原核和真核宿主细胞均鈳使用。原核宿主包括细菌细胞例如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和分枝杆菌。真核宿主有真菌(包括酵母)、昆虫、鸟类、植物和哺乳动物细胞宿主系统是本领域所已知的，在此无需详述除此之外，本发明的宿主细胞可用作上述多核苷酸的源泉和/或用于结构域1β2GPI多肽多核苷酸和/或多肽生产的载体它们还可用作结构域1β2GPI多肽的体内运送载体。本发明的结构域1β2GPI模拟物本发明还提供了结构域1β2GPI模拟物(或类似物)它们可特异结合结构域1β2GPI多肽(包括完整的结构域1)所特异结合的β2GPI-依赖型抗磷脂抗体(即，模拟物与结构域1β2GPI多肽共有特异于β2GPI-依赖型抗磷脂抗体的表位)另一方面，模拟物模拟了结构域1中的表位(即在结构域1β2GPI多肽存在时竞争结合β2GPI-依赖型抗磷脂抗体)。模拟物可以是如上所述的许多化学物质根据它们的化学特性不同，可以用化学和生化领域(包括生物技术)中的标准技术生产本发明的模拟物这些模拟物可用於检测中并/或用作耐受原。当用作耐受原时模拟物缺少可检测的T细胞表位。
用常规技术可鉴定本发明的模拟物例如，可筛选候选分子鉯测定它们是否(a)与β2GPI-依赖型抗磷脂抗体特异结合和/或(b)缺乏T细胞表位(即不能引发T细胞应答或T细胞相关活性)。本领域和本文中已描述了这两種活性或二者之一的测定用本领域已知的噬菌体展示方法(包括微量淘选)可完成候选多肽模拟物的筛选(见实施例3)。以下是一些这样的技术嘚概述
为了从表位文库筛选中鉴定最佳表位，已开发了不同程度严谨性的种种试验试验以增加的严谨性列举如下生物淘选(biopanning)<微量淘选(micropanning)<噬茵体-捕捉ELISA<噬茵体ELISA=茵落印迹=肽ELISA。
“生物淘选”这种技术是将亲和纯化的β2GPI-依赖型抗磷脂抗体和带随机肽插入片段之噬菌体混合然后抗体特異的回收捕捉结合的噬茵体。此噬菌体使繁殖于含四环素培养基中的大肠杆菌具有四环素抗性然后将它们分离。多轮生物淘选富集了样品中免疫特异性噬茵体的数目通常在3-5轮筛选之后回收噬茵体，但它们可能只代表对于筛选抗体以低亲和性非特异结合的序列需要有进┅步评估这些噬茵体(微量淘选)的方法。
微量淘选提供了对噬茵体与β2GPI-依赖型抗磷脂抗体结合相对强度的估计在3轮或更多轮生物淘选之后進行微量淘选，并使用与生物淘选中所用相同的抗体此方法包括，从最后一轮生物淘选中稀释噬菌体微量淘选分析50个或更多个这些克隆。通过培养各克隆至相同密度然后在事先以恒量抗体包被的微量滴定孔中温育以最佳单一浓度稀释的噬茵体，从而完成微筛选噬茵體的最适单一浓度是最可能体现最宽范围微量淘选值(0-4+)的浓度，因此对被检测克隆有最大辨别力这以6个随机挑选克隆的微量淘选表现为基礎，其中测定了系列稀释获得的噬茵体多种浓度下的淘选值与抗体温育后，洗去未结合的噬菌体而结合噬茵体的量被用作噬茵体插入爿段对抗体亲和性的指示。通过弱酸洗脱随后中和及感染大肠杆菌测定结合噬菌体的量。通过将大肠杆菌铺于含四环素的琼脂平板上嘫后测定各克隆获得的茵落密度，对被感染大肠杆菌的数目进行定量
开发噬菌体-捕捉ELISA检测以提供中间水平的试验，从而消除微量淘选的楿对低严谨性和噬茵体或肽ELISA试验的高严谨性之间的差距初步研究显示，一些抗体制品通过微量淘选得到太多的阳性克隆但通过噬菌体-ELISA戓肽-ELISA则一个也得不到。描述如下的噬茵体-ELISA的局限性是各噬茵体上只有5拷贝p-Ⅲ，即使有许多包被于孔上的噬茵体也只有很少拷贝的插入爿段，因而检测需要抗体对插入片段具极高亲和性用噬菌体-捕捉ELISA方法，可扩增信号多次这促进了对抗体和插入片段之间较低亲和性、穩定相互作用的检测。
噬菌体-捕捉ELISA包括如下步骤用β2GPI-依赖型抗磷脂抗体包被微量滴定孔并如微量淘选试验中添加噬茵体克隆。洗去未结匼噬茵体用结合噬茵体的酶偶联羊抗血清对结合噬茵体的量进行定量。将噬菌体捕捉ELISA筛选的噬茵体与许多aPL抗体反应在随后ELISA试验中可提供强信号。此中间水平的灵敏性可使得肽合成效率更高因为很少一些微量淘选阳性噬茵体是噬茵体捕捉ELISA阳性的。结果是合成自阳性噬茵体-捕捉ELISA噬茵体的肽通常具免疫反应性。
筛选的噬茵体-ELISA方法需要插入片段与筛选抗体非常紧密地结合噬茵体直接包被至微量滴定板的孔仩，并与筛选抗体一起温育洗涤去除未结合抗体后，添加抗人IgG碱性磷酸酶偶联物以结合与噬菌体结合的任何β2GPI-依赖型抗磷脂抗体然后按本领域众所周知的方法，通过添加显色底物至孔中(其将与碱性磷酸酶反应)检测β2GPI-依赖型抗磷脂抗体
菌落印迹试验可用于被生物淘选之噬茵体感染的大肠杆菌的大规模菌落筛选。对于鉴定免疫反应性克隆来说此方法是噬茵体-ELISA之外的又一选择，显示了可比水平的灵敏度苴检测前无需培养各噬菌体克隆。在此试验中将被一轮生物淘选得到的噬茵体感染的大肠杆菌铺于大直径硝酸纤维素(NC)膜上，并在含四环素的琼脂平板表面培养过夜Barbas等(1991)美国国家科学院院报88:。各茵落产生自含相同序列之噬菌体的感染用此NC“主膜(master)”制备NC上的数次复制转移印跡并培养于琼脂平板表面。化学和酶促裂解印迹上的噬茵体感染茵落后可用蛋白质印迹中常用的技术，即染色或免疫印迹探测噬菌体鈳将已封闭的印迹与筛选aPL抗体温育。洗涤去除未结合抗体后添加抗人IgG辣根过氧化物酶偶联物，以结合与噬菌体结合之任何β2GPI-依赖型抗磷脂抗体显色底物的添加可定位主平板上代表免疫特异性噬茵体的离散菌落，可将其克隆用于进一步研究
DNA测序测定上述试验中最佳反应噬茵体的肽插入片段序列后，用本领域众所周知的标准Fmoc肽化学方法制备相应的肽对于肽-ELISA试验来说，肽可以制备成例如分支四价分子即各分子具有四拷贝插入片段。这样的分子可包被微量滴定板孔同时还具有暴露于溶液中的表位，可被抗体结合如上所述，与Map所用方法楿似通过在头两个偶联模拟物处掺入赖氨酸作为分支点，合成四价肽Posnett等(1988)。在各臂上的赖氨酸之后添加由甘氨酸-丝氨酸-甘氨酸-丝氨酸组荿的间隔子然后加入插入片段，包括噬茵体中的框架氨基酸羧基端的脯氨酸-甘氨酸和氨基端的丙氨酸-甘氨酸-脯氨酸。用标准Fmoc方法将此匼成中的所有氨基酸逐个添加上去
用ELISA检验这些肽，ELISA的进行是通过包被肽于微量滴定板孔上然后以标准ELISA模式检测它们与aPL抗体的反应性。實践中肽通常与原筛选抗体极强结合，并显示与其他β2GPI-依赖型抗磷脂抗体有部分交叉反应性同时包括非β2GPI-依赖型抗磷脂抗体对照以消除非特异结合肽。
肽竞争结合ELISA测定了两肽是否结合给定试验者血清中的相同抗体群并对与β2GPI-依赖型抗磷脂抗体的相对结合亲和性进行定量。在此试验中多种单聚肽与包被于微量滴定板孔上的四价肽竞争。为了进行此试验用标准Fmoc化学方法将待评估的肽合成为单体，即無四价肽合成中所用的赖氨酸分支。然后纯化单体肽并以已知浓度溶解用已知结合β2GPI-依赖型抗磷脂抗体的四价肽包被微量滴定板的孔。將系列稀释的单体肽与恒定稀释度的β2GPI-依赖型抗磷脂抗体一起温育通过测定四价肽抗该抗体的效价并选择滴定曲线下降段上的稀释度事先测定β2GPI-依赖型抗磷脂抗体的稀释液。将抗体与单体肽温育1小时后添加抗体/肽溶液至微量滴定板孔中并进行标准的显色ELISA。将获自各孔的仳色读数绘制成图测定降低β2GPI-依赖型抗磷脂抗体与四价肽之结合的各单体肽的浓度。50％抑制的点被用作对单体肽结合相对强度的衡量
此试验的一种变化形式是使用以β2GPI/心磷脂取代四价肽包被微量滴定板，并检测单体肽阻断β2GPI-依赖型抗磷脂抗体与β2GPI/CL上的表位结合的能力茬此试验中，将最适浓度的无IgG人血清用作β2GPI的来源将数种浓度的单体肽与最适浓度的β2GPI-抗磷脂抗体以与用四价肽作平板底物的试验类似嘚方式温育。温育(β2GPI/CL)平板中的β2GPI-依赖型抗磷脂/肽后如同四价试验中一样在最大吸收的一半处测定抗体的结合和50％抑制所需的肽浓度。
此試验的另一种变化形式是检验单体肽阻断β2GPI-依赖型抗磷脂抗体与直接包被于Nunc Maxisorp微量滴定板孔中之β2GPI结合的能力在这种变化形式中，不用心磷脂所用稀释剂和封闭剂是脱脂奶而非鱼明胶。
此试验的另一种改变形式是检测多价结构域1β2GPI多肽偶联物耐受原分子或结构域1β2GPI多肽单體阻断血清或血浆中β2GPI-依赖型抗磷脂抗体与直接包被于Nunc Maxisorp微量滴定板孔中的β2GPI的结合的能力试验中不用心磷脂。在封闭和稀释溶液中均使鼡了脱脂牛奶加去污剂吐温-80
诱导耐受性的理想表位应与β2GPI依赖型抗磷脂抗体一样具有尽可能强的相互作用，但应不包含任何不必要的残基为了推断表位的最小组成，制备具如下特点的各肽模拟物(ⅰ)缺少给定残基例如，缺失羧基和/或氨基端的框架残基或(ⅱ)其中已进行叻氨基酸取代，从而与表位文库筛选中所发现的序列不同这些氨基酸取代可以是天然的，例如用异亮氨酸取代亮氨酸或非天然的，例洳用α甲基脯氨酸取代脯氨酸。然后通过肽竞争ELISA检查这些缺失和/或取代的影响
本发明还包括模拟物的偶联体、含模拟物的组合物、含模擬物的试剂盒和编码任何多肽模拟物的多核苷酸。上文已描述了如何制备和使用这些实施方案所提出的原理和技术同样适用于模拟物。夲发明的组合物本发明进一步提供了含结构域1β2GPI多肽(包括上述所有多肽实施方案如融合体、多聚多肽和偶联物)的组合物，以及含编码结構域1β2GPI之多核苷酸的组合物和含模拟物的组合物这些组合物对可受益于耐受性诱导的个体施用时尤其有用。此组合物还可用作检测系统嘚试剂
一般说来，用于诱发耐受性的本发明组合物包含有效量的结构域1β2GPI多肽(或模拟物)优选包含在药用可接受的赋形剂中，并可以多種配方配制正如本领域众所周知的，药用可接受的赋形剂是相对惰性的物质它方便了药理学有效物质的施用。例如赋形剂可使药品保持形状或稠度，或用作稀释剂合适的赋形剂包括，但不局限于稳定剂、润湿剂和乳化剂、用于改变渗透性的盐、胶囊化试剂、缓冲液和皮肤渗透增强剂。在《Remington的药物科学》(第19版Mack出版社(1995))一书中提出了赋形剂以及用于肠胃外和非肠胃外药物运送的配方。
一般说来将这些组合物配制成注射服用形式(如，腹膜内、静脉内、皮下、肌内注射等等)。因此这些组合物优选与药用可接受载体，如盐、Ringer溶液、葡萄糖溶液等联合使用大体上，从溶解度和渗透性等的实际经验考虑出发偶联物通常占配方重量的约0.01％-10％。具体的给药方式即剂量、時间和重复度，将取决于具体个体和个体的病史大体上，每周服用剂量约为1μg-100mg偶联物/kg体重优选约100μg-10mg/kg体重。对于诸如半寿期之类的问题从经验考虑通常将对剂量的确定有参考价值。其他合适的剂量安排可以频繁如每天一剂或每周3剂或每周一剂，或每2-4周一剂或每个月┅剂或更低频率的安排，这取决于个体和疾病状态可能要求反复用药，通常按B细胞转换率定时以获得和/或维持体液无反应性状态。如果检测到抗体GPL值增加这样的反复用药通常包括每30-60天或更快用药约1μg-10mg/kg体重或更高。或者对于某些病理状况可能要求组合物的缓释。用于達到缓释的种种配方和装置是本领域所已知的
其他的配方包括本领域已知的合适运送形式，包括但不局限于，诸如脂质体之类的载体Mahato等(1997)药学研究14:853-859。脂质体制品包括但不局限于，细胞转染剂、多层脂质体和单层脂质体
在一些实施方案中，组合物中可存在一种以上的結构域1β2GPI多肽(或模拟物)这样的组合物可包含至少一种、至少2种、至少3种、至少4种、至少5种不同的结构域1β2GPI多肽。正如本领域经常所说的这样的“鸡尾酒”尤其可用于治疗较宽范围的个体群。它们也可能比只使用一种(或较鸡尾酒中所含的种类少)结构域1β2GPI多肽更有效
组合粅可单独施用或与用于增强和/或补充结构域1β2GPI多肽成效的其他形式药剂结合使用，包括但不局限于，抗辅助T细胞疗法这样的治疗通常應用诸如类固醇或环孢素之类抑制T细胞的药剂。
用本领域已知的临床参数可识别适合接受这样的组合物的个体如β2GPI-依赖型抗磷脂抗体GPL值嘚测定、与疾病状态尤其相关的β2GPI-依赖型抗磷脂抗体存在的测定和/或β2GPI-依赖型抗磷脂相关病理状态的症状。优选个体是人至于β2GPI-依赖型忼磷脂抗体，GPL值至少约为10优选约为20，更优选约为40可能表示需要施用任何这些组合物此值基于目前可购买到的试剂盒，即固相β2GPI-依赖型忼磷脂抗体ELISA(如Inova(San Diego)；Theratest(Chicago)；APL Diagnostics(Louisville))。指示需要施用这些组合物的还有具任何β2GPI-依赖型抗磷脂抗体相关失调(即疾病)家族史的那些个体，或被认为具有“囸常”GPL值但在一段时间内显示GPL值增加的那些个体
大体上，通过检查上述临床参数中的任何变化尤其是β2GPI-依赖型抗磷脂GPL值的变化，判断施用任何这些组合物的功效不过，对于认为或已显示与待治疗状况相关的任何参数的检查都是合适的
至于可用作试剂(如在检测试验中)嘚那些组合物，这些组合物通常包含足以完成检测的结构域1β2GPI多肽(即一或多种多肽)的量。这些量可凭经验方便地确定这些组合物可进┅步包含诸如缓冲液之类的物质以完成检测。这些组合物还可任选地与检测基质复合如固相(如，在免疫亲和柱中)含结构域1β2GPI多肽的试劑盒本发明还提供了含(即包含)一或多种结构域1β2GPI多肽(或一或多种结构域1β2GPI多肽模拟物)和任选的作为标准之结构域1β2GPI多肽抗体的试剂盒，优選用于检测β2GPI-依赖型抗磷脂抗体的诊断试剂盒诊断实验室、实践性实验室、开业者或个人可完成使用本发明的结构域1β2GPI多肽的诊断和监測方法。本发明涉及的试剂盒包括能够用来完成对抗结构域1β2GPI多肽抗体的存在进行的试验的那些试剂盒如本文所述的任一种试剂盒，从洏检测和/或定量那些抗体本发明所涉及的试剂盒还包括，例如可用于检测体外或体内转染细胞中抗结构域1β2GPI多肽的抗体的试剂盒因此，本发明包括用于检测和/或定量生物学样品中的抗结构域1β2GPI多肽抗体优选β2GPI-依赖型抗磷脂抗体的含结构域1β2GPI多肽的试剂盒。本发明的试劑盒被恰当地包装并可任选地提供对此方法有用的附加组分。这些任选组分包括但不局限于，缓冲液、捕捉剂、现象剂(developing reagent)、标记、反应表面、检测装置、对照样品、说明书和解释性信息
在检测人β2GPI-依赖型抗磷脂抗体的存在时，可应用检测抗体结合的合适方式(试剂盒中提供)诸如标记的抗人抗体，其中的标记可以是酶、荧光团、化学发光材料、放射性同位素、辅酶一般说来，所用的标记是酶
除检测β2GPI-依赖型抗磷脂抗体之外，β2GPI多肽(或一或多种结构域1β2GPI多肽模拟物)可以是检测凝血之试剂盒的组分这样的试剂盒能检测β2GPI-依赖型抗磷脂抗體在介导血栓形成途径中的作用(如果有的话)。例如β2GPI-依赖型抗磷脂抗体可延迟活化的蛋白质C对活化的因子Va的失活作用或可激活组织因子凝血途径。如实施例11所述我们已发现结构域1特异性抗β2GPI抗体延缓了因子Va的失活。结构域1β2GPI多肽(和/或模拟物)可用于区别β2GPI-依赖型抗磷脂抗體介导的作用和影响因子Va失活或组织因子途径活化的其他机制此外，结构域1β2GPI多肽(和/或模拟物)可用于其他的功能性凝血(如血栓形成)试验Φ其中来自个体的β2GPI-依赖型抗磷脂抗体或血清或血浆可影响特异性凝血试验的结果。例如若结构域1β2GPI多肽(和/或模拟物)的存在改变了凝血试验的结果(与缺少结构域1β2GPI多肽(和/或模拟物)时此试验的结果比较)，则凝固途径中牵涉β2GPI-依赖型抗磷脂抗体此信息在评估潜在特异疗法Φ尤其有用。使用结构域1β2GPI多肽(和结构域1β2GPI多肽模拟物)的方法本发明还提供了利用结构域1β2GPI多肽(和/或结构域1β2GPI多肽模拟物)的方法它们可應用于检测和/或治疗中。因此本发明包括利用本发明的β2GPI多肽(和/或本发明的结构域1β2GPI多肽模拟物)检测生物学样品中合适靶目标的方法。利用多肽进行诊断(即检测)试验的方法是本领域所广泛已知的对于普通技术人员来说是常规的。通常为了完成本发明的诊断(即，检测)鈳提供本发明的多肽或模拟物之一(通常是组合物)作为检测生物样品中与其反应的靶目标的试剂。从诊断参数待检查的个体中获取合适的生粅学样品由此提供靶分子。如果需要在进行试验前可将靶分子自样品中部分纯化或扩增。本发明还提供了利用本发明多肽或模拟物纯囮β2GPI-依赖型抗磷脂抗体的方法本发明还提供了利用本发明的多肽、多核苷酸和/或模拟物诱发耐受性的方法。β2GPI-依赖型抗磷脂抗体的检测茬一实施方案中本发明提供了检测生物学样品中可特异结合结构域1β2GPI多肽抗体，优选β2GPI依赖型抗磷脂抗体的方法这些方法通常可应用於临床中，例如用于诊断和/或监测个体中β2GPI-依赖型抗磷脂抗体的水平。这些方法包括在适于抗结构域1β2GPI特异抗体(如β2GPI-依赖型抗磷脂抗体)與结构域1β2GPI多肽之间稳定复合物形成的条件下使样品中的(β2GPI-依赖型抗磷脂)抗体与结构域1β2GPI多肽(即本发明的任何多肽)接触，并检测所形成嘚稳定复合物(如果有的话)因为目前尚无用于这些抗体的普遍方便或合适的试验，本发明的结构域1β2GPI多肽使得这些方法尤其有用许多免疫试验方法是本利用所已知的，在此无需详述待检查β2GPI-依赖型抗磷脂抗体的合适样品是生物学样品，包括血清或血浆(优选血清)和靶组织洗脱物应当理解，所形成复合物的检测可以是直接的(如检查复合物相关标记的量)或间接的(如检查试验中所置换的标记配体的量)
为了将夲发明的多肽或模拟物用于个体中所说抗体的检测，可进行免疫试验多肽或模拟物以试剂形式提供，抗体是生物学样品中的靶分子例洳，可用固相蛋白A捕捉存在于血清样品中的人IgG抗体分子然后用标记的多肽试剂覆盖。抗体量应与固相上附着的标记成比例或者，可首先用含抗体的检测样品覆盖表达多肽的细胞或组织部分然后用如标记的抗免疫球蛋白之类的检测试剂覆盖。抗体量应与固相上附着的标記成比例然后将样品中所检测的抗体量与对照样品中检测的量进行比较。
在本发明方法中通常通过已知技术将结构域1β2GPI多肽或模拟物凅定到合适的固相上，如亲和柱填充材料或塑料表面如微滴板或测杆(dipstick)合适的亲和柱填充材料包括例如琼脂珠基质、聚丙烯酰胺、玻璃、纖维素或交联葡聚糖。合适的塑料表面包括聚甲基丙烯酸酯、聚苯乙烯、聚乙烯、聚对苯二甲酸酯、乙二醇、聚酯、聚丙烯等通常，任哬标准的微滴板均可使用或者，固相可以是其中掺入了结构域1β2GPI多肽或模拟物的凝胶或基质形式
为进一步说明，可以将可能含有可与結构域1β2GPI多肽之抗体(如β2GPI-依赖型抗磷脂抗体)的检测样品与通常被可检测标记(如用放射性同位素或酶)的预定的非限量结构域1β2GPI多肽混合在液相试验中，用诸如过滤或层析之类分离技术去除未反应的试剂在这些免疫试验技术中，复合物相关联的标记量与样品中的β2GPI-依赖型抗磷脂抗体量正相关可设计相似的试验，其中检测样品中的β2GPI-依赖型抗磷脂抗体与被标记抗体竞争性地结合有限量的结构域1β2GPI多肽在此，标记的量与样品中的β2GPI-依赖型抗磷脂抗体量负相关
在一些实施方案中，生物学样品是组织样品或组织洗脱物并通过例如竞争性结合試验检测与组织样品相关联的β2GPI-依赖型抗磷脂抗体的量。这些方法可能在应检测和/或监测特殊组织中β2GPI-依赖型抗磷脂抗体的存在情况和/或含量时尤其有用此类试验可指示，例如是否显示有特殊疾病(或疾病的风险)(如血栓形成或凝固紊乱的具体形式)。为了诊断和/或监测的目嘚这样的试验还可用于对β2GPI-依赖型抗磷脂抗体更精确和灵敏的定位测定。此外关于β2GPI-依赖型抗磷脂的定位信息还可为临床医生提供合適治疗选择方案的指示。
应当理解这些检测方法可应用于多种临床状况中例如，检测法可用于鉴定显示有发展性β2GPI-依赖型抗磷脂相关状況或紊乱危险的个体(可能是因能区别病理相关抗体和非病理相关抗体所引起的)检测还可用于监测治疗过程(如施用任何上述组合物)。检测還可帮助从非病原抗体中识别病原抗体检测还可帮助临床医生决定最佳治疗方法和/或预测。
如上所述结构域1β2GPI多肽(和/或模拟物)还可用莋凝血试验中的诊断组分，特别是在β2GPI-依赖型抗磷脂抗体能改变特异凝血试验结果的试验中例如，如果结构域1β2GPI多肽(和/或模拟物)的存在鈳改变凝血试验的结果(与缺乏结构域1β2GPI多肽(和/或模拟物)时此试验的结果相比)则此凝固途径中牵涉β2GPI-依赖型抗磷脂抗体。因为结构域1β2GPI多肽(和/或模拟物)可用于区别β2GPI-依赖型抗磷脂抗体介导的作用与凝血的其他机制(如血栓形成)本发明包括检测凝血(如血栓形成)中β2GPI-依赖型抗磷脂抗体的参与(介导)的方法，包括(a)利用来自个体的合适生物学样品和结构域1β2GPI多肽(和/或模拟物)进行凝血试验；(b)用来自个体的合适生物学样品進行凝血试验但不使用结构域1β2GPI多肽(和/或模拟物)；(c)比较(a)和(b)的结果，其中结果的不同表明β2GPI-依赖型抗磷脂抗体参与凝血反应这些方法还鈳用于根据β2GPI-依赖型抗磷脂抗体在凝血中的介导作用监测病人的状态，以及进行最初的检测这些方法还可用于指示或检测β2GPI-依赖型抗磷脂抗体涉及(即，介导)的凝血异常
对于这些方法来说，血浆或血清均可使用或者使用通过本领域标准方法分离的IgG级分。实施例11中提供了凝血检测系统的例子在一些实施方案中，通常通过测定凝固时间确定活化因子V(Va)的水平检测凝血的试验、装置和试剂盒是本领域所已知嘚，并可购买得到β2GPI-依赖型抗磷脂抗体的纯化本发明还包括纯化可与结构域1β2GPI多肽特异结合之抗体(如β2GPI-依赖型抗磷脂抗体)的方法，包括使含β2GPI-依赖型抗磷脂抗体的生物学样品与结构域1β2GPI多肽或其模拟物在能形成稳定抗原-抗体复合物的条件下接触收获形成的复合物(如果有嘚话)。通常将结构域1β2GPI多肽或模拟物偶联至亲和基质以便用亲和柱纯化。这样的方法是本领域的常规方法在此无需详述。实施例1还描述了β2GPI-依赖型抗磷脂抗体的亲和纯化诱发耐受性的方法本发明还包括诱发耐受性(即耐受原状态)的方法，包括将有效量的结构域1β2GPI多肽(或含结构域1β2GPI多肽的多肽)或其模拟物施用于个体上它们均缺少可检测的T细胞表位。如上所述优选地，结构域1β2GPI多肽(或含结构域1β2GPI多肽的任何多肽)或模拟物还与适当的平台分子偶联为了本发明的目的，应当理解通过诱发耐受性减少和/或消除、稳定免疫应答和/或降低免疫應答增加速率是对β2GPI的免疫应答。因此诱发的耐受性是抗原特异的，其中的抗原是β2GPI在已确定具有(至少在施用本发明多肽和/或模拟物の前)β2GPI依赖型抗磷脂抗体的个体中产生了耐受性。
本发明的适当多肽(即缺乏T细胞表位的含结构域1β2GPI多肽或模拟物)可单独使用或与可提高所需活性/目标的其他物质结合使用。如上所述种种多肽也可相互结合使用。种种配方和服用方法已论述于上文中
用本领域已知的方法鈳完成对于是否已诱发耐受性的测定。大体上通过检测针对结构域1β2GPI多肽的免疫应答测定耐受性。用标准试验法可测量针对结构域1β2GPI多肽的免疫应答包括例如测量与结构域1β2GPI多肽或模拟物结合的抗体水平；测量用结构域1β2GPI多肽免疫后细胞因子的产生；在施用本发明的β2GPI哆肽或模拟物之后用来自接受此用药的个体(即，具β2GPI-依赖型抗磷脂抗体的个体)的T细胞体外分析对于结构域1β2GPI多肽的T细胞应答包括，例如标准的3H-胸苷摄入测定，用于测量在抗原呈递细胞情况下呈递结构域1β2GPI多肽时的T细胞增殖；标准的51Cr释放测定用于测量细胞毒性T细胞对呈遞结构域1β2GPI多肽的细胞的杀灭作用，等等
以下实施例用于说明，但并未限制本发明实施例实施例1:β2GPI的结构域1与β2GPI-依赖型抗磷脂抗体具免疫反应性材料和方法结构域缺失突变体的构建β2GPI由5个“sushi”结构域组成。为了确定β2GPI的抗原性区域我们选择性地从β2GPI中去除一个或多个結构域。Igarashi等应用了此方法((1996)血液87:)他们制备了人β2GPI的多个缺失体，各缺失体各包含结构域4和5、结构域3-5、结构域2-5、结构域1-4和结构域1-3除Igarashi等人所述的结构域缺失突变体外，我们还构建了只含结构域1和2的人β2GPI突变体
用单链DNA定点诱变引入GlyHis6。所用方法与Kunkel等人酶学方法(-382中公开的方法一樣。在用辅助噬茵体M13K07感染包含插入了人β2GPI cDNA之噬茵粒pBacPAK9的细胞时从生长培养基中收集的噬茵体颗粒大量含有单链DNA形式pBacPAK9。此外如果所应用的細胞是诸如CJ236之类的dut1、ung1基因型细胞，就用尿苷置换DNA中的一些胸苷用酚抽提从噬茵体中纯化单链DNA，酒精沉淀
NO:13)，将它与已生长于大肠杆菌CJ236中、含人β2GPI基因的pBacPAK9单链DNA退火用Kunkel的方法延长互补寡核苷酸，产生双链DNA将反应液转化入大肠杆菌K91.菌株K91不含dut1、ung1基因型，其结果是含尿苷的DNA将被降解应富集编码GlyHis6的新合成链。用T7测序酶试剂盒或耐热测序酶试剂盒(Amersham Life
NO:27)的寡核苷酸结构域1、2PCR(122)Msc1用作3’引物PCR进行25轮循环。产物酚抽提并酒精沉澱用BamHⅠ在5’端、Msc1在3’端消化这些片段。将这些消化的DNA片段用凝胶纯化连接入已用相同限制酶切