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【求助】双酶切怎么就切不开了呢？急！！
[color=green][/color]各位前辈大家好，最近我用ECOR1和Xba1双酶切从菌液中回收的质粒，用的载体是PGEM-T载体，目的片段994大小，用质粒做模板也P过出现了目的片段大小条带，可总切不开，按说明书先用一个单独切回收后再用另一个切，也用过两个同时在一个体系里切，改变各体系中各种试了N次了，从没切出来过，急死了！对了，我用的这两个酶不是同一厂家的，发现说明书上终止反应的条件也不同（我做的另一个基因的双酶切就很顺利，用的两个酶是在一个厂家同时买的，可是这有关系吗？难道我还得再去买吗？）有哪位做遇到过这类问题吗，怎么办才好？请给我些建议好吗，多多谢谢！！！！！你先分别单切，看是否两个酶切位点存在，并且能被酶切。另外，如果你的片段是连接上去的，就存在一定的概率不能recut。这两个酶一起很好切,没理由切不开,两个公司的可以一起切.你要检查一下有没有这个位点,是不是公司送错了T载体类型,我碰倒过,作了两周,结果T载体是错的,呵呵.祝好运非常感谢二位的回复！之前先单切过，如果有位点存在条带是比质粒大是吗， 这是什么原理呢，以前没做过这个所以如果问的弱智不要见笑，也问过身边的同学也没说出个所以然。单切的时候跑电泳发现和质粒一样大，看来真的没位点？为什么呢，我的目的片段上是加了这两个酶切位点的呀，前一个基因做的比较顺利没出现这个问题所以还小高兴了一把。
可是如果没位点怎么办？重新要做转化连接吗？
恳切期待前辈指点一二！！！那就是说没连上了，片断没插入，当然得重新连接了。做过PCR了，抽质粒也用MARKER验证了，是载体加目的条带大小。请教高手为什么呢？为什么连上了确切不开呢这样的问题，我遇到过很多次，把所有的都验证了一遍，最后原因就是引物合成时，就偏偏在加的酶切位点处合成错了。我想你的一定也是这个问题。我觉得也有可能是因为Xba I切不动甲基化后位点，如果单酶切能切动，应该能看到一条比质粒大的条带，因为线性DNA电泳比环形的慢些谢谢楼上二位的回复，实验郁闷索性回家过五一了。dengww的情况其实就是我担心的，在园子里看到过这种情况，那样的话合成公司也太讨厌了白白浪费我们的大好时光。niebaoming,我才知道线性比环形泳动慢，需要多学习啊。真是太难过了，到现在我还没有切出来。我用Xba1先单切，图如下，为什么是两条比较大的带呢，是不是时间不够长还是酶量加少了右边两个是同样的体系，右数第三个是抽提的质粒，左边MARKER2000，回收了最靠近加样孔的带取5ul跑下电泳什么也没看到，所以又不能再用ECOR1继续切了；还有在一起切的话请问做过的高手做双酶切的话时间大概都用过多少啊，我最长用过五小时，是不是会短了切不开啊，太着急了，请大家帮帮我吧！！！！！帮忙看看有问题吗，，，用Xba1单切时的体系：Xba1：1ul, 10乘Mbuffer:2百分之0.1BSA :2 质粒 DNA:24ul
加水至50ul两个酶双切用的体系：
10乘Mbuffer:2ul
百分之 0.1BSA :2ul
质料DNA: 10ul
Ecor1:1ul加水 至20ul
Image00000.bmp (243.34k)图象“Image00000.bmp (243.34k) ”没什么问题。提取的质粒很好。酶切后的质粒变成了线性，因此跑的更慢一些。酶切后出现的2条带，上面是切开后的，下面是没被切开的。原因应该是质粒的量太多了，所以内切酶搞不定所致。总双切不开，5555555。。。。。
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