几种常见的基因测序技术的优缺点及应用
几种常见的基因测序技术的优缺点及应用
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随着人类基因组计划的完成，人类对自身遗传信息的了解和掌握有了前所未有的进步。与此同时，分子水平的基因检测技术平台不断发展和完善，使得基因检测技术得到了迅猛发展，基因检测效率不断提高。从最初第一代以 Sanger 测序为代表的直接检测技术和以连锁分析为代表的间接测序技术，到 2005 年，以 Illumina 公司的 Solexa技术和 ABI 公司的 SOLiD 技术为标志的新一代测 序 (next-generation sequencing，NGS) 的 相 继 出现，测序效率明显提升，时间明显缩短，费用明显降低，基因检测手段有了革命性的变化。其技术正向着大规模、工业化的方向发展，极大地提高了基因检测的检出率，并扩展了疾病在基因水平的研究范围。2009 年 3 月，约翰霍普金斯大学的研究人员在《Science》杂志上发表了通过 NGS外显子测序技术，发现了一个新的遗传性胰腺癌的致病基因 PALB2，标志着 NGS 测序技术成功应用于致病基因的鉴定研究。同年，《Nature》发表了采用 NGS 技术发现罕见弗里曼谢尔登综合征MYH3 致病基因突变和《Nat Genet》发表了遗传疾病米勒综合征致病基因。此后，通过 NGS 技术，与遗传相关的致病基因不断被发现，NGS 技术已成为里程碑式的进步。2010 年，《Science》杂志将这一技术评选为当年&十大科学进展&。
近两年，基因检测成为临床诊断和科学研究的热点，得到了突飞猛进和日新月异的发展，越来越多的临床和科研成果不断涌现出来。同时，基因检测已经从单一的遗传疾病专业范畴扩展到复杂疾病和个体化应用更加广阔的领域，其临床检测范围包括高危疾病的新生儿筛查、遗传疾病的诊断和基因携带的检测以及基因药物检测用于指导个体化用药剂量、选择和药物反应等诸多方面的研究。目前，基因检测在临床诊断和医学研究的应用正越来越受到医生的普遍重视和引起研究人员的极大的兴趣。
本文介绍了几种 DNA 水平基因检测常见的方法，比较其优缺点和在临床诊断和科学研究中的应用，对指导研究生和临床医生课外学习，推进临床科研工作和提升科研教学水平有着指导意义。
1、第一代测序
1.1 Sanger 测序 采用的是直接测序法。1977年，Frederick Sanger 等发明了双脱氧链末端终止法，这一技术随后成为最为常用的基因测序技术。2001 年，Allan Maxam 和 Walter Gibert 发 明了 Sanger 测序法，并在此后的 10 年里成为基因检测的金标准。其基本原理即双脱氧核苷三磷酸 (dideoxyribonucleoside triphosphate，ddNTP) 缺乏PCR 延伸所需的 3'-OH，因此每当 DNA 链加入分子 ddNTP，延伸便终止。每一次 DNA 测序是由 4个独立的反应组成，将模板、引物和 4 种含有不同的放射性同位素标记的核苷酸的 ddNTP 分别与DNA 聚合酶混合形成长短不一的片段，大量起始点相同、终止点不同的 DNA 片段存在于反应体系中，具有单个碱基差别的 DNA 序列可以被聚丙酰胺变性凝胶电泳分离出来，得到放射性同位素自显影条带。依据电泳条带读取 DNA 双链的碱基序列。
人类基因组的测序正是基于该技术完成的。Sanger 测序这种直接测序方法具有高度的准确性和简单、快捷等特点。目前，依然对于一些临床上小样本遗传疾病基因的鉴定具有很高的实用价值。例如，临床上采用 Sanger 直接测序 FGFR 2 基因证实单基因 Apert 综合征和直接测序 TCOF1 基因可以检出多达 90% 的与 Treacher Collins 综合征相关的突变。值得注意的是，Sanger 测序是针对已知致病基因的突变位点设计引物，进行 PCR 直接扩增测序。单个突变点的扩增包括该位点在内的外显子片段即可，不必将该点所在基因的全部外显子都扩增。
因此，应明确定位要扩增的位点所在的基因外显子和该点的具体位置，设计包括该点在内的上下游 150 ~ 200 bp 的外显子片段引物。此外，尽管有NGS 的出现，但 Sanger 测序对于有致病基因位点明确并且数量有限的单基因遗传疾病的致病基因的检测是非常经济和高效的。到目前为止，Sanger 测序仍然是作为基因检测的金标准，也是 NGS 基因检测后进行家系内和正常对照组验证的主要手段。
值得注意的是，Sanger 测序目的是寻找与疾病有关的特定的基因突变。对于没有明确候选基因或候选基因数量较多的大样本病例筛查是难以完成的，此类测序研究还要依靠具有高通量测序能力的 NGS。虽然 Sanger 测序具有高度的分析准确性，但其准确性还取决于测序仪器以及测序条件的设定。另外，Sanger 测序不能检测出大片段缺失或拷贝数变异等基因突变的类型，因此对于一些与此相关的遗传性疾病还不能做出基因学诊断。
1.2 连锁分析 采用的是间接测序法。在 NGS 出现之前，国际通用的疾病基因定位克隆策略是建立在大规模全基因扫描和连锁分析基础上的位置候选基因克隆。人类的染色体成对出现，一条来自父亲，一条来自母亲，每一对染色体在同样的位置上拥有相同的基因，但是其序列并不完全相同，被称为父系和母系等位基因。遗传标记是指在人群中表现出多态现象的 DNA 序列，可追踪染色体、染色体某一节段或某个基因座在家系中传递的任何一种遗传特性。它存在于每一个人，但大小和序列有差别，具有可遗传性和可识别性。目前采用第二代遗传标记，即重复序列多态性，特别是短串联重复序列，又称微卫星标记。连锁分析是以连锁这种遗传现象为基础，研究致病基因与遗传性标记之间关系的方法。如果控制某一表型性状的基因附近存在遗传标记，那么利用某个遗传标记与某个拟定位的基因之间是否存在连锁关系，以及连锁的紧密程度就能将该基因定位到染色体某一位置上。1986 年 Morton 等提出优势对数记分法 (log odds score method，LOD)，主要检测两基因以某一重组率连锁时的似然性。LOD 值为正，支持连锁 ;LOD 值为负，则否定连锁。通过计算家系中的微卫星标记与致病位点之间的 LOD 值，可以初步估算二者间的遗传距离及连锁程度，从而确定该基因在染色体上的粗略位置。然后利用该区域的染色体基因图谱，分析定位区域内所有基因的功能与表达，选择合适的候选基因进行突变检测，最终将致病基因定位或克隆。
然而，采用连锁分析进行基因检测存在很大的局限性。不但所需遗传样本量较大，一般要求提供三代及以上遗传家系患者血样，而且数据量大、处理复杂、产出速度较慢、定位不够精确 ( 一般只能定位在染色体某一区间 )，这就使得研究工作繁重和定位基因的时间周期特别长。目前，连锁分析采用的单核苷酸多肽性和短串联重复序列还在使用，但经典的间接测序方法，如单链构象多肽性、变性梯度凝胶电泳和异源双链分析在美国已被淘汰，而在发展中国家作为研究手段还在有限使用。
2、新一代测序 (NGS)
主 要 包 括 全 基 因 组 重 测 序 (whole-genomesequencing，WGS)、全外显子组测序 (whole-exomesequencing，WES) 和目标区域测序 (Targeted regionssequencing，TRS)，它们同属于新一代测序技术。总体而言，NGS 技术具有通量大、时间短、精确度高和信息量丰富等优点，使得遗传学者可以在短时间内对感兴趣的基因进行精确定位。但这些不同的测序技术在测序范围、数据分析量以及测序费用和时间等方面又有很大差别，如果选择适合的方法，对于临床诊断和科学研究将起到事半功倍的作用。
2.1 目标区域测序 目前常用的是基因芯片技术。其测序原理是基于 DNA 杂交原理，利用目标基因组区域定制的探针与基因组 DNA 进行芯片杂交或溶液杂交，将目标基因区域 DNA 富集，再通过NGS 技术进行测序。其测序过程是通过把数以万计的 cDNA 或寡聚核苷酸置于芯片上制成列阵，将芯片上固定好的已知序列的核苷酸探针与溶液中含有荧光标记的相应核酸序列进行互补配对，根据测序仪所显示强荧光的位置和强度，获取每组点阵列信息，再利用生物信息学算法确定目的靶核苷酸的序列组成。测序所选定的目标区域可以是连续的 DNA 序列，也可以是分布在同一个染色体不同区域或不同染色体上的片段。目标区域测序技术，对于以往通过连锁分析将基因突变锁定在染色体某一片段区域内，但无法找出突变是一个非常好的进一步检测手段。2010 年，Nicholas等使用基因分型芯片联合连锁分析技术，成功发现头小畸形的新基因 WDR62，文章发表在《NatGenet》杂志。类似的研究在家族性胰腺癌中确定 8 个候选变异位点和在家族性渗出性玻璃体视网膜病变发现易感基因 TSPAN12。
基因芯片测序技术可以将经过连锁分析锁定了目标范围或经过全基因组筛选的特定基因或区域进行更深一层的研究，是解决连锁分析无法发现致病基因的有效手段。基因芯片技术对于已知基因突变的筛查具有明显优势，可以快速、全面地检测出目标基因突变。同时，由于目标区域受到了限制，测序范围大幅度减少，测序时间和费用相应降低。但基因芯片检测所需要的 DNA 的量要大，由于已提取的 DNA 存在降解的风险，用于基因芯片研究的血标本最好是冰冻的全血，这样可以使用于检测 DNA 的量有充分保证。
2.2 全外显子组测序 (WES) 外显子组是单个个体的基因组 DNA 上所有蛋白质编码序列的总合。人类外显子组序列约占人类全部基因组序列的 1%，但大约包含 85% 的致病突变。WES 是利用序列捕获技术将全外显子区域 DNA 捕捉并富集后进行高通量测序的基因分析方法。采用的技术平台主要是罗氏公司的 SeqCap EZ 全外显子捕获系统，Illumina 公司的 Solexa 技术和 Agilent 公司的 SureSelect 外显子靶向序列富集系统。其捕获的目标区在 34 ~ 62 M 之间，不仅包括编码区同时也加入了部分非编码区。NGS 的测序过程主要包括DNA 测序文库的制备、锚定桥接、PCR 扩增、单碱基延伸测序和数据分析。研究者根据测序仪捕获到在测序过程中掺入有不同荧光标记碱基片段，经计算机将荧光信号转化成不同颜色的测序峰图和碱基序列。基因测序结果与NCBI的SNP数据库、千人基因组数据库等国际权威数据库比对，最终确定是否为突变基因。
自NGS 技术问世以来，利用 WES 在临床疾病致病基因的鉴定研究中取得前所未有的成果。这些成果不仅集中在单基因遗传疾病，还在多基因影响的复杂疾病中获得大量相关基因的发现。在单基因遗传性疾病中，如视网膜色素变性、终端骨发育不良等发现新基因或已知基因新突变。在一些罕见的疾病中，如 Kabuki 综合征、家族性混合型低脂血症和脊髓小脑共济失调症等疾病中发现新的致病基因。同时，在小细胞肺癌、慢性淋巴细胞性白血病等肿瘤研究和诸如肥胖症、脑皮质发育不良等复杂疾病的研究中也取得丰硕成果。
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IL-12细胞因子家族的新成员----IL-35_干细胞搜网
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IL-12细胞因子家族的新成员----IL-35
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IL-35是最新发现的IL-12细胞因子家族成员，由两个亚基组成的异二聚体，即EBI3和IL-12p35。EBI3由EB病毒感染的B淋巴细胞诱导产生，是编码为34kDa的糖蛋白，27%的氨基酸与IL-12p40相同；IL-12p35与其他单链细胞因子如IL-6同源。1997年Devergne等发现EBI3和IL-12p35可以聚合为新的造血因子，且在体内形成异二聚体，但未对其功能进行研究。直到20...
IL-35是最新发现的IL-12细胞因子家族成员，由两个亚基组成的异二聚体，即EBI3和IL-12p35。EBI3由EB病毒感染的B淋巴细胞诱导产生，是编码为34kDa的糖蛋白，27%的氨基酸与IL-12p40相同；IL-12p35与其他单链细胞因子如IL-6同源。1997年Devergne等发现EBI3和IL-12p35可以聚合为新的造血因子，且在体内形成异二聚体，但未对其功能进行研究。直到2002年，Pflanz等将EBI3和IL-12p28偶联形成异二聚体IL-27，才激发了人们对EBI3-IL-12p35的重新研究，并将其正式命名为IL-35。2007年，Niedbala等1。和Collison等两个研究小组分别在《European Journal of Immunology》和《Nature》杂志上发表了IL-35的生物学功能，使IL-35成为近期研究的热点。
一、IL-35的结构和受体
IL-35是IL-12细胞因子家族的新成员，到目前为止，IL-12家族还包括IL-12、IL-23和IL-27，均是由两条链构成的异二聚体。IL-12是最早发现的该家族成员，由IL-12p35和IL-12p40共价结合而成。IL-12p35属于Ⅰ型细胞因子，表达无处不在，而IL-12p40的表达则是诱导性的。IL-12p35和IL-12p40基因调节的分离提示二者可分别与其他成分结合，IL-12p40与IL-23p19共价结合组成IL-23，EBI3与IL-27p28结合形成IL-27，但与IL-12和IL-23的不同之处在于其并非由双硫键共价结合而成。
下面对IL-12细胞因子家族成员的受体做一介绍。
1.&对IL-12而言，功能性IL-12R与gp130同源，是由IL-12R&l和IL-12R&2组成的异二聚体，结构上属于Ⅰ型细胞因子受体超家族。IL-12R&1是一种含有二硫键的Ⅰ型跨膜蛋白，可与IL-12结合。IL-12R&1表达于T细胞，NK细胞和DC细胞上，而IL-12R&2表达于NK细胞和活化的T细胞，促Th1分化的细胞因子同样可促进其表达，而促Th2分化的细胞因子则可对其起到抑制作用，与IL-12R&1不同，IL-12R&2主要发挥信号转导作用。lL-12的信号通路包括Jak2、Tyk2和一些信号转导蛋白和转录激活蛋白（STAT）家族成员，包括STAT1、STAT4和STAT5，其中，STAT4发挥主要作用。研究发现，缺乏IL-12R&1/IL-12R&2、Tyk2/Jak2或STAT4的小鼠在T细胞和NK细胞上IL-12信号转导受损。
2.&IL-23受体由IL-12R&1和IL-23R两个亚基组成，IL-23R主要表达于活化和记忆性T细胞，也少量表达于NK细胞，单核/巨噬细胞和树突状细胞（DC）中，IL-23R与配体结合后使胞内区酪氨酸发生磷酸化，通过Tyk2/Jak2和STAT家族尤其是STAT3发挥信号转导作用；同IL-12R&2一样，IL-23R主要发挥IL-23的信号转导作用。
3.&IL-27受体由WSX-1和gp130两个亚基组成，其中WSX-1主要结合配体，gp130发挥信号转导作用。WSXI胞浆区具有酪氨酸磷酸化残基，可使STAT家族成员胞内区酪氨酸发生磷酸化，但WSX1单独与lL-27结合时却不能转导信号，只有两个亚基同时存在才能发挥信号转导作用。
4.&IL-35的受体和信号通路目前尚不明确，鉴于IL-35同其他家族成员的相似性，推测IL-35受体也是由两个亚基构成。IL-35由EBI3和IL-12p35组成，考虑IL-35受体可能分别与IL-12和IL-27的1个亚基结合而发挥信号转导作用，IL-12的亚基p35与IL-12R&2结合，推测IL-12R&2组成IL-35受体的1条链，但IL-27R通过WSX-1和gp130共同发挥作用，且IL-27的两个亚基分别与哪条链结合目前尚不明确，只能推测WSX-I或gp130可能组成IL-35受体的另一条链。根据已知的IL-12和IL-27活化信号通路考虑STAT4，或许还有STATI和STAT3参与IL-35的信号转导。令人费解的是，虽然拥有相同的信号通路，在下游区转录后却发挥完全相反的功能，即IL-12和IL-27具有刺激功能而IL-35则发挥抑制作用。另有一种解释为IL-35拥有自己独特的受体，但尚需进一步证实。
IL-12、IL-23和IL-27最初均被认为是促炎性或刺激性细胞因子，可促进T细胞增殖和细胞因子分泌。T细胞和DC细胞可通过CD40L和CD40结合来增强IL-12、IL-23和IL-27的分泌。IL-27发现之初，认为其协同IL-12促进T-bet和IL-12R&2表达以使得初始T细胞和NK细胞分泌IFN-&增多。这一发现说明IL-27可使T细胞增殖以发挥IL-12的作用，对Th1细胞早期分化发挥重要作用。但近期研究发现，IL-27除促进Th1细胞增殖外还具有宿主调节活性。同抗-IL-12p40一样，IL-27p28也可使Th1致病的实验性自发性脑脊髓膜炎（experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE）病情减轻。即IL-27可抑制EAE的进展，此功能部分依赖于IL-10。最新报道称IL-27可抑制Th1源性感染，限制Th2活性，阻断Th17细胞分化及TGF-&诱导的Treg细胞形成。另外，同健康***血相比，脐带血中EBI3和p28mRNA表达显著升高，说明IL-27可能在母胎免疫耐受中发挥重要作用。IL-27是IL-12家族成员中第一个既有促炎义有免疫调节作用的成员。
IL-35作为该家族的新成员，表达于CD4+T细胞群中静息和活化的调节性T（Treg）细胞，而不表达于效应性T（Teff）细胞，Treg细胞要产生并表达大量的IL-35需要与Teff细胞结合，可使Treg细胞发挥抑制活性。早期研究发现，EBI3和p35在胎盘滋养层中表达量较高，提示IL-35可同IL-27-样在胎盘屏障中发挥免疫调节。此作用是源于Treg细胞介导的母体对胎儿应答的抑制，还是分泌IL-35的其他细胞亚群发挥的抑制作用尚不明确。
二、IL-35的生物学功能
1.&IL-35为Treg细胞发挥功能所需：Treg细胞是CD4+T细胞中的关键亚群之一，在机体免疫稳态、移植耐受和肿瘤免疫逃逸等过程中均发挥着重要作用。但其免疫抑制功能尚不明确，IL-35在Treg细胞中的组成性表达为这一疑问提供了新的线索。
早期研究报道指出，Treg细胞通过T细胞抗原受体（TCR）发挥免疫抑制作用。后来，研究者分析活化的Treg细胞中EBI3和IL-12amRNA表达是否会受Teff细胞的影响，结果显示，经过抗-CD3和抗-CD28共刺激培养Teff细胞后，EBI3和IL-12amRNA的表达水平显著降低，但从体外环境恢复的Treg细胞中EBI3和IL-12amRNA的表达水平却显著升高，且与其抑制过程相一致。在EBI3-/-和IL-12a-/-小鼠中，EBI3-IL-12a（IL-35）缺失可导致负性调节丧失，同时促炎性细胞因子IL-27和IL-12分别在EBI3-/-和IL-12a-/-小鼠中缺失，但EBI3-/-小鼠中最终以促炎作用占主导，使得其对利什曼病更易感。与IL-12-/-小鼠不同，IL-12a-/-小鼠对螺旋菌属所诱导的大肠炎、硕大利什曼原虫感染，EAE和胶原诱导的关节炎（collagen induced arthritis，CIA）更易感。研究已证实Treg细胞在淋巴细胞减少、重组活化因子缺失（Rag-/-）的环境中可控制Teff细胞的自身稳定扩散。此外，体外实验中也分析了EBI3-/-和IL-12a-/-Treg细胞抑制野生型Teff细胞增殖的能力，结果显示其抑制能力显著降低，与Teff细胞的数量无关。有研究分别将纯化的野生型Teff细胞与野生型Treg或EBI3-/-或IL-12a-/-Treg细胞一起过继转移入Ragl-/-小鼠中，结果证实EBI3-/-或IL-12a-/-Treg细胞组中Teff细胞扩增基本上无变化，而野生型Treg细胞组Teff细胞扩增则显著减少，说明EBI3与p35结合组成的异二聚体细胞因子IL-35可发挥免疫抑制作用。但近期研究表明，与小鼠Treg细胞不同，离体人Treg细胞不表达显著的EBI3mRNA，Treg细胞和Teff细胞之间p35mRNA的表达无显著区别，即人体内EBI3mRNA和p35mRNA均不受Treg细胞Foxp3过表达的影响，与小鼠相反，IL-35可能并不能促***Treg细胞发挥抑制Teff细胞增殖的作用。慢性丙型肝炎（CHC）和白限性丙型肝炎病毒感染研究中发现，在Treg细胞和效应细胞共培养体系中加入中和抗-IL-35能有效阻断Treg细胞介导的抑制效应细胞增殖的作用&。IL-35是否在人体内对Treg细胞的免疫抑制效应发挥作用尚待进一步研究。
2.&IL-35为抗炎应答所需：鉴于Treg细胞在临床上对治疗类风湿性关节炎起着重要作用，有研究在DBA/1小鼠中建立胶原诱导的关节炎（CIA）模型来研究IL-35的作用，PBS处理的对照组小鼠按预期的病程进展，而IL-35处理的小鼠在手掌关节炎发生率和数量方面均显著降低；同PBS处理的小鼠相比，IL-35处理组小鼠组织学改变明显好转，表明IL-35能有效抑制CIA的进展，同时阻止关节破坏的进展。IL-35处理组小鼠血清中IL-10浓度明显升高，IL-10通过抑制IKBs激酶（IKK）和核因子&B（NF-&B）DNA的结合来阻止NF-&B激活编码促炎细胞因子的基因转录，从而减少促炎性细胞因子的产生。但Collison等发现Teff分泌的IL-10也可能发挥相同的调节作用，当Treg细胞与IL-10-/-Teff细胞共培养时，所发挥的抑制效应较与野生型Teff细胞共培养时降低。另外，炎症性肠病（inflammatory bowel disease，IBD）模型中，Treg敲除组可发生严重的病理改变，包括杯状细胞分泌黏液能力丧失，黏膜增生，大面积溃疡或CD3+T细胞浸润，显著的透壁性淋巴组织细胞炎症及炎症浸润引起的正常生理功能破坏，而野生型Treg组中发现炎症和CD3+T细胞浸润明显减轻且杯状细胞再生，黏液再分泌。在IL-12家族成员中，IL-27可通过活化STAT1和下游效应细胞因子信号抑制物3（Socs-3）而发挥免疫抑制功能。然而，IL-35的抗炎机制尚不清楚。
3.&IL-35为CD4+CD25+Treg和CD4+CD25-Teff细胞表达所需：Niedbala等从BALB/c小鼠的脾和淋巴结中纯化CD4+CD25+和CD4+CD25-T细胞并用含抗-CD3和抗-CD28培养基进行进行培养，T细胞可最大程度的被活化。结果表明，IL-35可明显扩增CD4+CD25+Treg细胞并伴有IL-10合成增加，同时也明显诱导CD4+CD25-Teff细胞的扩增并伴有IFN-&浓度升高，此与IL-35在Treg细胞中的免疫抑制功能相矛盾。此外，Lund等报道了相似的发现，感染部位的早期抗病毒免疫应答事实上是由Treg细胞首先发起的，Treg和Teff细胞同步扩增，甚至比例保持相对固定。研究发现Treg细胞受损后可导致DC、NK细胞和淋巴结间质细胞分泌的趋化因子（CCL2、CXCL9和CXCL10）过度聚集，这些趋化因子能进一步招募周围的DC、NK和T细胞到淋巴结，并在此扩大免疫应答，导致真正的感染部位抗病毒应答失活，使病毒有足够的时间加重感染。即Treg细胞能扩增并将免疫Teff细胞从淋巴结移位至病毒感染部位。EBI3-p35（IL-35）主要为Treg细胞发挥免疫刺激活性所需，因为EBI3可以诱导巨噬细胞合成巨噬细胞炎性蛋白1（MIP-1），后者可进一步招募B和T淋巴细胞到炎症部位。但是，Treg和Teff细胞之间的T细胞抗原受体（TCR）不同，Treg细胞对外源性抗原的应答情况以及IL-35是否对此发挥作用尚需进一步研究。另外，有研究提示Treg细胞可被Teff细胞分泌的IL-2同步触发。
4.&IL-35抑制Th17细胞的分化：近期研究表明，与对照组相比IL-35处理组可明显抑制Th17的分化。研究发现TGF-&可通过加速Th17分化来增强促炎性应答的作用。IL-35可上调IFN-&，后者可抑制TGF-&受体下游效应器Smad-3磷酸化，以此来阻断TGF-&和其受体结合，使Th17细胞分化受阻，说明IL-35可抑制Th17细胞的分化。Th17细胞以分泌IL-17和IL-22为特征，其中IL-17具有宿主和免疫防御作用；IL-22介导IL-23诱导的Th17细胞增殖；孤儿受体&t（ROR&t）是Th17细胞分化的重要转录因子。EBI3缺失可上调IL-17、IL-22和ROR&t的表达，也证实了IL-35在Th17分化中所起的免疫抑制作用。
三、结论和瞻望
综上，IL-35作为IL-12细胞因子家族的一个新成员，具有免疫抑制功能；既能扩增CD4+CD25+Treg细胞，又能扩增CD4+CD25-Teff细胞。在急性感染期，IL-35可诱导Th1细胞增殖来清除病原体，同时通过抑制Th17细胞分化来阻止过度的自身免疫反应，还可扩增Treg和Teff细胞，但Treg细胞在随后的慢性感染阶段却发挥抑制Teff细胞的作用，以阻止对机体的免疫损伤。Collison等研究发现，经IL-35预处理的传统T细胞可诱导分化为一类新型iTreg细胞，被称为&iTR35细胞&，抗体阻断实验结果证实其是通过IL-35，而非IL-10或TGF-&来发挥免疫抑制作用的。此发现证明IL-35是除TGF-&和IL-10之外又一类介导Treg细胞发挥抑制作用的重要细胞因子。目前认为Treg细胞及其分泌的细胞因子具有持久的免疫耐受效应，从而推断IL-35在病毒感染的免疫耐受期发挥重要的作用。
据法国学者报道，尽管CD3/CD28刺激可诱导人各种CD4+T细胞亚群少量表达EBI3，但在人类Treg细胞中却未能检测到EBI3；另外，p35mRNA在Treg和Teff细胞中均可检测到，而EBI3mRNA仅在活化的Teff细胞中表达，在静息或活化的Treg细胞中不表达，这与小鼠体内情况是不同的，说明IL-35在人类T细胞中的作用尚不明确。因此，IL-35受体、IL-35相关的信号通路、人类和小鼠T细胞中IL-35的表达形式及发挥生物学功能的分子机制均需要进一步的探讨。随着对IL-35研究的增多和不断变化，或许可以提供给临床一种新的顽固性免疫性疾病的治疗方案，如1型糖尿病和系统性红斑狼疮等。
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