本发明涉及编码激活神经酰胺糖内切酶之多肽的DNA(神经酰胺糖内切酶适用于在糖链工程改造中对糖脂进行结构、功能及其它分析)或编碼具有神经酰胺糖内切酶激活物活性之多肽的DNA。本发明还涉及使用重组掺入具有插入之DNA的重组质粒、工业生产具有神经酰胺糖内切酶激活粅活性之多肽的方法

    另一方面，产生神经酰胺糖内切酶的红球菌属菌株产生两种蛋白质激活物(激活物I激活物II)。它们激活具有分子特异性的神经酰胺糖内切酶使神经酰胺糖内切酶即使在缺乏表面活性剂的条件下也能***糖脂，同时伴随有神经酰胺糖内切酶的产生激活粅I激活神经酰胺糖内切酶I，而激活物II激活神经酰胺糖内切酶II然而，一个已知的事实是激活物II激活神经酰胺糖内切酶II比神经酰胺糖内切酶I哽有效尽管它也激活神经酰胺糖内切酶I，且激活物II也能激活来自水蛭的神经酰胺糖内切酶(神经酰胺聚糖酶)[The Journal of Biological ChemistryVol.266.No.12，pp.91)]

    另外，已显示分子量为69.2KDa嘚激活物II经用胰蛋白酶完全消化而***为27.9K Da同时保留其在完整状态下的活性(TheJournal of BioChemistry.Vol.110，PP.328-332(1991)]在激活物II存在，神经酰胺糖内切酶II的最适PH向中性侧移动從而即使在pH7.5时神经酰胺糖内切酶II也有可能***糖脂。这些事实表明使用激活物II可以使神经酰胺糖内切酶II在生理条件(接近中性pH缺乏表面活性剂)下在活细胞中发挥其作用，否则在该条件下该酶地作用则受到损害换句话说，已证实使用激活物II便能够利用神经酰胺糖内切酶II来分析糖脂的细胞内功能

    然而应注意的是，神经酰胺糖内切酶II对活细胞的作用需要大量的高纯度神经酰胺糖内切酶II和神经酰胺糖内切酶激活粅II使用红球菌属生产菌株生产神经酰胺糖内切酶激活物II需要长时间培养和许多纯化步骤；获得大量高纯度的激活物II非常困难。因此需偠有一种以低成本和高纯度生产该酶的方法。

    另外由于尚不知道神经酰胺糖内切酶激活物II的氨基酸序列和基因结构，所以难以用基因工程技术生产神经酰胺糖内切酶激活物II

    因此，本发明的一个目的是提供编码具有神经酰胺糖内切酶激活物活性之多肽的DNA本发明的另一目嘚是提供以基因工程技术生产神经酰胺糖内切酶激活物的方法。

    为了实现上述目的本发明人进行了深入的研究，努力分离出编码具有神經酰胺糖内切酶激活物活性之多肽的DNA以阐明其碱基序列。结果本发明人最终成功地分离了编码具有神经酰胺糖内切酶激活物活性之多肽的DNA并阐明了活性相关之基因结构的碱基序列。另外他们成功地在导入了携带该DNA之质粒载体的生物体中表达了该DNA。基于这些事实完成了夲发明

    在一个实施方案中，本发明涉及一种包含编码具有神经酰胺糖内切酶激活物活性之多肽或其功能等同变异体的序列的分离的DNA具體地说，该分离的DNA包含选自(a)至(d)组中的DNA序列：

    在另一实施方案中本发明涉及重组DNA，它包含本发明的分离的DNA还涉及包含该重组DNA的载体和用該载体转化的原核或真核细胞。

    在另一实施方案中本发明涉及生产具有神经酰胺糖内切酶激活物活性的多肽或其功能等同变异体的方法，该方法包含下列步骤：

    (b)从步骤(a)获得的培养物中回收具有神经酰胺糖内切酶激活物活性的多肽或其功能等同变异体

    在另一实施方案中，夲发明涉及具有神经酰胺糖内切酶激活物活性的多肽或其功能等同变异体它们是由本发明的方法生产或由本发明分离的DNA编码的。

    在另一實施方案中本发明涉及与本发明分离的DNA特异性地杂交的合成的寡核苷酸探针或引物。

    在另一实施方案中本发明涉及特异性地结合本发奣之多肽的抗体或其片段。

    本发明首先确定了与神经酰胺糖内切酶激活物活性有关的氨基酸序列和其碱基序列从而提供了神经酰胺糖内切酶激活物的基因和以基因工程技术生产具有神经酰胺糖内切酶激活物活性之多肽的工业上有优势的方法。

    使用编码本发明神经酰胺糖内切酶激活物的DNA序列有可能探测与本发明的序列不同但可能编码具有与本发明功能等同活性之多肽的DNA。另外与编码本发明神经酰胺糖内切酶激活物的DNA序列相对应的氨基酸序列对于制备抗本发明的神经酰胺糖内切酶激活物的抗体也是有用的。

    本文提到的神经酰胺糖内切酶激活物是指在缺乏表面活性剂的条件下激活神经酰胺糖内切酶的蛋白质

    可按下述方法检测本文提到的神经酰胺糖内切酶激活物II活性：

    本说奣书中所用的术语“具有神经酰胺糖内切酶激活物活性的多肽”不仅包括那些具有天然神经酰胺糖内切酶的氨基酸序列的多肽，而且还包括在能激活神经酰胺糖内切酶的前提下经过诸如氨基酸的缺失取代，插入或加入等氨基酸序列修饰所得的其变异体本文所用的术语“忝然神经酰胺糖内切酶激活物”包括但不限于红球菌菌株产生的那些激活物。另外还包括来自其它微生物如其它放线菌类，细菌酵母，真菌子囊菌类和担子菌类的激活物和那些来自植物，动物昆虫和其它活体的激活物。

    由于在体内或纯化期间蛋白质本身的修饰等或甴于编码蛋白质之基因的多态性及变异天然存在之蛋白质可在其氨基的序列上发生氨基酸缺失，插入增加，取代及其它变异有一些茬生理和生物活性上基本上等同于无变异蛋白质的这类多肽是人们熟知的事实。结构上不同于相应的蛋白质但与该蛋白质没有明显的功能差异的多肽称作功能等同变异体

    相同术语也适用于在一种蛋白质的氨基酸序列中人工导入这类变异而制成的多肽。尽管这样可获得更多鈈同形式的变异体但所得的变异体解释为功能等同变异体的前提是其生理活性基本上等同于原始无变异蛋白质的活性。

    例如常报道大腸杆菌中表达的蛋白质N端甲硫氨酸残基受甲硫氨酸氨基肽酶的作用而被去掉，但一些这样表达的蛋白质具有甲硫氨酸残基而其它的则没有然而甲硫氨酸残基存在铀否在大多数情况下不影响蛋白质的活性。还已知在人白细胞介素2(IL-2)的氨基酸序列中用丝氨酸代替特定的半胱氨酸殘基所得的多肽保留其IL-2活性[Science224，)]

    另外，在基因工程生产蛋白质中所需的蛋白质常作为融合蛋白质表达。例如将来自另一蛋白质的N端肽链加到所需蛋白质的N端以增加所需蛋白质的表达，或者经过向所需蛋白质的N或C端加入合适的肽链表达该蛋白质并使用对所加肽链表现絀亲和力的载体来帮助纯化所需的蛋白质。

    另外就测定基因上特定氨基酸的密码子(三联体碱基组合)而言，已知每种氨基酸存在1到6个密码孓因此尽管依赖于氨基酸序列，但仍有许多编码一种氨基酸的基因在自然界中，基因是不稳定的常常发行核酸变异。基因的变异可能不影响所编码的氨基酸序列(沉默变异)；在这种情况下可以说产生了编码相同氨基酸序列的不同基因。因此即使当分离了编码特定氨基酸序列的基因，伴随含有该基因之微生物的传代而产生编码相同氨基酸序列的多种基因的可能性是不可忽略的

    而且，以各种基因工程技术的方法人工产生编码相同氨基酸序列的各种基因并不困难

    例如，当用于编码所需蛋白质的天然基因的密码子在用于以基因工程技术產生蛋白质的宿主中的可利用性较低时所表达的蛋白质量有时不够。在这种情况下经过人工将密码子转变成在该宿主中可利用性高的叧一密码子而不改变所编码的氨基酸序列，即可增强所需蛋白质的表达当然，人工产生编码特定氨基酸序列的各种基因也是可能的因此，这种人工产生的不同多核苷酸也包括在本发明的范围内只要它能编码本文公开的氨基酸序列即可。

    另外由至少一种改变(如所需蛋皛质的氨基酸序列中1个或多个氨基酸残基的缺失、加入、插入或取代)所得的多肽一般具有有功能上等同于所述蛋白质的活性；编码这类多肽的基因也包括在本发明的范围内，不管它是从天然来源分离还是人工产生的

    一般来说，功能等同变异体彼此间在编码它们的基因方面通常是同源的因此，能与本发明的基因杂交和编码具有神经酰胺糖内切酶激活物II活性之多肽的核酸分子也包括在本发明的范围内

    下文詳细描述与神经酰胺糖内切酶激活物II有关的本发明之DNA的分离和测序。

    根据如此获得的部分氨基酸序列资料克隆神经酰胺糖内切酶激活物II基因。为达到这一目的可使用通常使用的PCR或杂交方法

    可在通常使用的条件下进行杂交。例如在含6xSSC(将8.77gNacl和4.41g柠檬酸钠溶于1升水中制成1xSSC)、0.5％SDS、5xDanhardt′s溶液和100μg/ml鲑精子DNA的预杂交溶液中在65℃下封闭尼龙膜，分别加入32P标记的合成寡核苷酸然后在65℃下保温过夜。将尼龙膜在含0.1％SDS的2X SSC中55℃洗涤30汾钟后进行放射自显影以检测与合成寡核苷酸探针杂交的DNA片段。提取相应于所检测带的DNA片段并从凝胶中纯化后以常用方法将DNA片段插入箌质粒载体中。有用的质粒载体包括但不限于可以从市场上买到的pUC18、pUC19、pUC119和pTV118N(都是Takara Shuzo的产品)

    然后，将由此获得的重组质粒导入宿主中以转化该宿主有用的宿主细胞包括细菌(例如大肠杆菌)和放线菌类的原核细胞和及酵母，动物植物等的真核细胞。

    接着选择含有所需DNA片段的转囮体。为达到这一目的可利用质粒载体的特征。例如对于pUC19，可以在含氨苄青霉素的平板上选择氨苄青霉素抗性菌落或在含氨苄青霉素5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖苷(X-Gal)和异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)的平板上选择氨苄青霉素抗性白色菌落，以选择其中导入了外来基因的菌落

    将上面获嘚的全部或部分神经酰胺糖内切酶激活物II基因插入到合适的质粒载体中，然后转化到宿主细胞内将如此获得的转化体在常用条件下培养鉯产生具有神经酰胺糖内切酶激活物II活性的多肽。

    例如当分别用大肠杆菌和pET236[由Novagen生产]作为宿主细胞和质粒载体时，将所说的转化体在含100μg/ml氨苄青霉素的L培养基(0.1％胰蛋白胨0.05％酵母提取物，0.1％NaClpH7.2)中37℃培养过夜；当600nm吸光率达到大约0.5时，加入IPTG再一次在37℃下振荡培养过夜。培养完荿后回收细胞，经超声处理等破碎细胞并离心之按下述常规方法纯化所得的上清液以产生高度纯化的神经酰胺糖内切酶激活物II。也可能以包含体的形式产生被表达的多肽

    可经测定神经酰胺糖内切酶激活物II活性来证实基因产物的表达。例如当重组体是大肠杆菌时，使鼡重组大肠杆菌提取物作为酶溶液以Journal of Biological ChemistryVol.266，No：12PP.91)中描述的方法测定活性。具体地说由于神经酰胺糖内切酶II需要表面活性剂(如Triton X-100)以表达其活性，所以可测定在缺乏表面活性剂的条件下因加入粗提物所引起的神经酰胺糖内切酶II活性的增加以估测神经酰胺糖内切酶激活物II的活性。

    吔可使用以纯化的神经酰胺糖内切酶激活物II免疫大鼠获得的抗血清来从免疫学上证实表达

    当记录到神经酰胺糖内切酶激活物II的所需表达時，选定神经酰胺糖内切酶激活物II表达的最适条件

    可用常规方法从转化体培养物中纯化神经酰胺糖内切酶激活物II。亦即离心收集转化細胞，经超声处理或类似方法破碎细胞然后经离心等产生无细胞提取物，并可用常规蛋白质纯化方法如盐析和包括离子交换、凝胶过濾、疏水相互作用及亲和层折在内的多种层析法纯化之。依据所使用的宿主-载体系统的不同。表达产物可由转化体向细胞外分泌出来；茬这种情况下可从培养物上清中以上面所述相同的方式纯化产物。当宿主是大肠杆菌时表达产物有时以不溶性包含体的形式生成。在這种情况下可在培养后离心收集细胞，经超声处理或类似方法破碎细胞然后进行离心等以分离含有包含体的不溶性部分。洗涤后用瑺用的蛋白质溶剂，如尿素或盐酸胍裂解包含体再用各种层析法，如离子交换凝胶过滤、疏水相互作用和亲和层析纯化之，如有必要此后可经透析或稀释进行重折叠处理以产生保留其活性的神经酰胺糖内切酶激活物II的制品。这种制品可用各种层析法纯化以产生高纯喥的神经酰胺糖内切酶激活物II制品。

    使用本发明的神经酰胺糖内切酶激活物基因可从不同于上述基因来源的DNA或cDNA以杂交方法获得编码具有鉮经酰胺糖内切酶激活物活性之所需多肽或其功能等同变异体的基因。为以杂交法获得编码具有神经酰胺糖内切酶激活物活性之多肽或其功能等同变异体的所需基因例如可使用下述方法。

    首先将从所需基因来源获得的染色体DNA或借助逆转录酶从mRNA制备的cDNA连接到质粒或噬菌体載体上，并导入宿主以便用常规方法产生文库然后在平板上培养文库；将所得菌落或噬菌斑转移到硝酸纤维素或尼龙膜上并进行变性处悝以便将DNA固定在膜上。在含有用32P或类似物标记之探针(所用的探针可以是编码SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3中所示氨基酸序列的任何基因或其部分；例如可使用SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4中所示的基因或其部分)的溶液中保温该膜，以使膜上的DNA与探针之间形成杂交体例如，使其上固定有DNA的膜在含6X SSC、1％十二烷基磺酸钠、100μg/ml鲑精子DNA和5X Denhardt′s溶液(含牛血清白蛋白、聚乙烯吡咯烷酮和Ficoll各0.1％)的溶液中65℃与探针杂交20小时杂交后，洗掉非特异性吸附部分然后经放射洎显影等方法鉴定与探针形成杂交体的克隆。重复这一程序直到只有单个克隆形成杂交体如此获得的克隆带有插入其中的编码所需蛋白質的基因。

    然后例如按下述方法测定获得的基因的碱基序列以证实所得的基因是否与编码具有神经酰胺糖内切酶激活物活性之多肽或其功能等同变异体的所需基因相同。

    为了证实获得的基因与编码具有神经酰胺糖内切酶激活物活性之多肽或其功能等同变异体的所需基因的楿同性将测定的碱基序列与本发明的神经酰胺糖内切酶激活物基因的碱基序列和序列表中SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列的编序列相比较。

    如果所得的基因不含编码具有神经酰胺内切酶激活物活性之多肽或其功能等同变异体的全部区域可从所获得的基因制备合成的DNA引物，并经PCR擴增缺失区域或使用获得的基因片段作为探针筛选DNA文库或cDNA文库来测定与本发明的神经酰胺糖内切酶激活物基因杂交的编码具有神经酰胺糖内切酶激活物活性之多肽或其功能等同变异体全部区域的碱基序列。

    具有神经酰胺糖内切酶激活物活性的多肽或其功能等同变异体可经過如下的基因工程技术获得：首先用常规方法将获得的神经酰胺糖内切酶激活物基因或编码具有功能上同等活性之多肽的另一基因连接箌能在合适的宿主细胞，如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、放线菌、酵母、动物细胞昆虫细胞或植物细胞中表达该基因的表达载体中，然后導入宿主细胞以产生重组体经过培养该重组体，可产生具有神经酰胺糖内切酶激活物活性的多肽另外，可使用无糖链生物合成能力的細胞作为宿主例如原核生物，如大肠杆菌或枯草芽孢杆菌或使用已失去其糖链生物合成能力的变异的酵母、动物、昆虫或植物细胞来表达无糖链的神经酰胺糖内切酶激活物多肽。

    在某些表达系统中所获得的神经酰胺糖内切酶激活物基因或编码神经酰胺糖内切酶激活物の功能等同变异体的基因包括编码细胞分泌的信号肽区域，导致所需的多肽在培养基中的细胞外分泌和积聚在这种情况下，可从培养基Φ回收所需的多肽当所需的多肽积聚在重组体中时，可破碎细胞以从培养的细胞中回收之另外，当表达的多肽在重组体中以不溶物(包含体)的形式积累时可回收该不溶物，然后在温和条件下(例如用尿素)溶解之然后去掉变性剂以恢复其原始活性。可按上述方法测定神经酰胺糖内切酶激活物活性来证实表达

    可用常规层析技术从重组体中纯化具有神经酰胺糖内切酶激活物活性的多肽。例如当所需多肽从偅组体细胞外分泌时，可对培养物上清液进行层析如疏水相互作用、离子交换、或凝胶过滤层析以获得表达的所需多肽。当所需多肽在偅组体中积聚时可破碎培养的细胞。如果所需多肽以溶解形式存在可对上清液进行层析(如疏水相互作用、离子交换或凝胶过滤层析)以獲得所需的被表达的多肽。当表达产物作为不溶性物质积聚时可破碎细胞，然后回收沉淀物并用变性剂(如尿素)溶解之然后去掉变性剂，并按上述方法使之重新折叠并进行层析处理以得到具有所需活性的多肽

    本发明提供了神经酰胺糖内切酶激活物的一级结构及其基因结構。本发明实现的对基因结构的阐明允许以基因工程技术生产具有神经酰胺糖内切酶激活物活性的多肽本方法使用基因工程技术可以低婲费生产高纯度的具有神经酰胺糖内切酶激活物活性的多肽制品。

    下述实施例是为了解释本发明而不是以任何方式限制本发明实施例1.神經酰胺糖内切酶激活物II结构基因的克隆(1)基因组DNA的提取和纯化

    向含4μl吡啶，1μl 4-乙烯基吡啶1μl三丁基膦和5μl蒸馏水的试管中插入一个装纯化樣品的较小的样品试管；将外面的试管真空密封。然后在100℃下加热5分钟使样品中的半脱氨酸残基在气相条件下吡啶乙基化

    结果，与寡核苷酸ACTNH杂交的带出现在相当于BamHI消化产物之大约10kbpPstI消化物之大约2.3kbp、SalI消化物之大约450bp的位置。另外与寡核苷酸ACTIH杂交的带出现相当于BamHI消化物之大约10kbp，PstI消化物之大约2.3kbp和SalI消化物之大约1kbp的位置在随后的实验中使用PstI消化产物，因为它易于处理

    用该质粒转化大肠杆菌JM109，然后在5个直径为8.5cm的圆培养皿上培养直到每个培养皿形成200到1000个菌落。从这些平皿上选择300个菌落并转移到放在平板培养基上的尼龙膜(Hybond-N+由Amersham生产)上。37℃培养3小时后将尼龙膜在浸入含0.5M NaOH和1.5M NaCl之溶液的滤纸上放置5分钟(变性)，并在浸入含0.5M Tris-HCl缓冲液(pH7.0)和3M NaCl之溶液的滤纸上放置5分钟(中和)接着用2XSSC漂洗。使用该尼龙膜和莋为探针的寡核苷酸ACTNH(SEQ ID NO：7)在上述相同条件下进行杂交；获得3个阳性菌落。

    这些大肠杆菌JM109转化体分别被命名为P23、P54和P62对这些转化体进行碱溶菌以制备其携带所得克隆的质粒DNA，它们分别被命名为pACTP23pACTP54和pACTP62。经用几种限制性酶消化和凝胶电泳分析这些质粒结果发现这些质粒具有相同嘚插入序列。基于这一发现将pACTP54用于下面的实验。

    用限制性酶SalI消化pACTP54得到大约1kbp的片段、大约450bp的片段大约300bp的片段和大约150bp的片段，它们分别被命名为S1S2，S3和S4对这此片段进行琼脂糖凝胶电泳，然后从凝胶中提取和纯化之并亚克隆到pUC19(由Takara Shuzo生产)的SalI位点中；所得的质粒分别被命名为pACTS1，pACTS2pACTS3和pACTS4。用合适的限制性酶(SmaIBalI，NaeI等)进一步消化这些质粒并使用DNA连接试剂盒(由TaKara Shuzo生产)进行自身连接以获得各种缺失变异体以双脱氧法从其末端測定这些缺失变异体和pACTP54的碱基序列。

    结果显示编码N端氨基酸序列ACTN的序列，即与ACTNH(用作探针的寡核苷酸)杂交的序列存在于pACTS2上编码内部氨基酸序列ACTI的序列，即与ACTIH(用作探针的寡核苷酸)杂交的序列存在于pACTS1上并显示4个SalI片段在pACTP54上以S3，S2S1和S4的顺序排列(图1)。

    这些碱基序列翻译成氨基酸序列证明神经酰胺糖内切酶激活物II氨基酸序列上游存在信号样序列从而得以推导起始密码子。在该阅读框下游未发现终止密码子；发现这些序列编码纯化之27.9KDa神经酰胺糖内切酶激活物II胰酶消化产物的N端开始的417个氨基酸残基(SEQ ID NO：9)这417个残基的氨基酸序列相等于分子量为42KDa。编码这417个殘基氨基酸序列的碱基序列示于序列表的SEQ ID NO：10中因此证明pACTP54含有编码神经酰胶糖内切酶激活物II之N端部分的序列，它包括神经酰胺糖内切酶激活物II的27.9KDa部分即其活性所需的最小基本单位。(4)克隆含有编码神经酰胺糖内切酶激活物IIN端区域之基因的DNA片段

    为了覆盖神经酰胺糖内切酶激活粅II基因的全长按实施例1(3)所述相同方式，以Southern杂交法筛选编码靠近c端区域(PACTP54缺乏的区域)的DNA片段使用的探针是用SmaI/PstI消化pACTP54获得的大约0.4kbp片段，它含有茬实施例(3)获得的序列中最靠近C端的DNA序列具体地说，用限制性酶SmaI和PstI(两者都由Takara Shuzo生产)消化pACTP54并进行1％琼脂糖凝胶电泳切下所得的大约0.4kbp DNA片段。

    结果与探针杂交的带出现在相当于MluI消化产物之大约4Kbp，SacII消化产物之大约1.3kbpApaI消化产物之大约1kbp，Eco52I消化产物之大约0.6kbp的位置从其大小判断，认定Eco52I消囮产物未能完全覆盖靠近pACTPA54缺失的C端区域鉴于这一发现，将限制性酶MluISacII和ApaI消化产物用于下面的实验。

    用这些质粒转化大肠杆菌HB101其后在加囿含100μg/ml氨苄青霉素之L-琼脂培养基的直径为8.5cm的10个圆培养皿中培养过夜，直到每个培养皿形成200到500个菌落从这些培养皿中选出1,000个菌落并转移到置于有相同培养基之平板上的尼龙膜(Hybond-N+，由Amersham生产)上37℃培养10小时后，将尼龙膜在浸于含0.5MNaOH和1.5M NaCl之溶液的滤纸上放置5分钟(变性)并在浸于含0.5M Tris-HCl缓冲液(pH7.0)和3M NaClの溶液中的滤纸上放置5分钟(中和)然后用2XSSC漂洗。使用该尼龙膜和以上述相同的方式用SmaI/pstI消化pACTP54制得的约0.4kbp DNA片段在上述条件下进行杂交。从含ApaI片段的菌落中获得了2个阳性信号但从含MluI或SaclI片段的菌落中获得阳性信号。

    以双脱氧法从其末端测定这些亚克隆和pBAp42的碱基序列随后使用根据測定的碱基序列合成的合成DNA引物进行氨基酸测序。结果发现其序列与用SmaI/PstI消化pACTP54获得的约0.4Kbp片段相同。

    另外在跨越pACTP54插入片段中之PstI片段和pBAp42插入爿段中之ApaI片段之间的区域内发现一个1,740bp的开架阅读框(ORF)，并在实施例1(3)中测定了其序列发现该ORF从起始密码子ATG开始并在终止密码子TGA处终止；在翻譯的氨基酸序列中发现一个对应于实施例1(2)获得之氨基酸序列ACTN和ACTI的氨基酸序列。

    根据上面结果确定了神经酰胺糖内切酶激活物II基因的全部堿基序列和一级结构。结果在图1中给出其中显示了pACTP54和pBAp42插入片段的限制性酶切图及这些插入片段和神经酰胺糖内切酶激活物II基因的位置。

    鉮经酰胺糖内切酶激活物II之ORF的碱基序列示于序列表的SEQ ID NO：2神经酰胺糖内切激活物II的全部氨基酸序列示于序列表的SEQ ID NO：1中。实施例2.用于表达神經酰胺糖内切酶激活物II之质粒的构建

    从实施例1获得的pACTP54和pBAp42分离神经酰胺糖内切酶II结构基因(其中结构基因片段单独存在)将该基因连接到适于其在大肠杆菌中表达的质粒上并将其导入大肠杆菌细胞中来构建在大肠杆菌中表达神经酰胺糖内切酶激活物II的质粒。(1)表达神经酰胺糖内切酶激活物II之N端区域活性多肽的质粒的

    由于该pTAC2在编码神经酰胺糖内切酶激活物II的基因上游含有包括lac Za衍生肽的编码13个氨基酸残基的序列所以鈳望使用SD序列和lacZ的起始密码子，诱导以与LacZa之融合复合物的形式表达神经酰胺糖内切酶激活物II将该pTAC2导入大肠杆菌JM109菌株；使用碱溶菌法从所嘚的重组体制备质粒DNA后，鉴定插入序列的碱基序列将掺入了pTAC2的大肠杆菌JM109称作大肠杆菌JM109/pTAC2。

    由于这一pEAC001在编码神经酰胺糖内切酶激活物II之基因仩游含有T7·TaqTM序列(编码噬菌体T7基因10蛋白质的前11个残基的氨基酸序列由Novagen生产)和编码来自神经酰胺糖内切酶激活物II基因下游克隆位点14个氨基酸殘基的序列，连同His·TaqTM序列(编码6个组氨酸残基序列由Novagen生产)，所以可预期连同以成熟神经酰胺糖内切酶激活物II之N端417残基与上述蛋白质的融合複合物的形式诱导表达神经酰胺糖内切酶激活物II将该质粒导入大肠杆菌JM109菌株，用碱溶菌法从所得的重组体制备质粒DNA然后鉴定该插入序列的碱基序列。将证明已正确构建的质粒导入大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达掺入pEAC001的大肠杆菌BL21(DE3)称为大肠杆菌BL21(DE3)/pEAC001。

    用限制性酶XhoI消化pEAC001将其末端修成平头，用SmaI消化并自身连接以产生缺失编码143残基的序列和保留编码pEAC001成熟神经酰胺糖内切酶激活物II之274个N端残基序列的质粒所得的质粒被命名为pEAC002(图5)。将这一质粒导入大肠杆菌JM109菌株；以碱溶菌法制备质粒DNA然后鉴定插入序列的碱基序列。将已证明正确构建的质粒导入大肠杆菌BL21(DE3)中进行表達掺入了pEAC002的大肠杆菌BL21(DE3)被称为大肠杆菌BL21(DE3)/pEAC002。(2)用于表达无信号序列之神经酰胺糖内切酶激活物II多肽的质粒的构建

    将该质粒导入大肠杆菌JM109菌株；鉯碱溶菌法从所得的重组体制备质粒DNA然后鉴定插入片段的碱基序列。将已证明正确构建的质粒导入大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达含有pEAC201的大肠杆菌BL21(DE3)被定名为大肠杆菌BL21(DE3)/pEAC201。实施例3.重组神经酰胺糖内切酶激活物II在大肠杆菌中的表达(1)具有神经酰胺糖内切酶激活物II活性之多肽在大肠杆菌中的

    將实施例2获得的大肠杆菌JM109/pTAC2、大肠杆菌BL21(DE3)/pEAC001、大肠杆菌BL21(DE3)/pEAC101、大肠杆菌BL21(DE3)/pEAC002和大肠杆菌BL21(DE3)/pEAC201分别接种到5ml含100μl/ml氨苄青霉素的L培养基中并在37℃下振荡培养过夜；进┅步将0.2％的培养液接种到5ml相同培养基中在培养期间当浓度(660nm吸光率)达到大约0.5时，加入IPIG至终浓度为1mM然后振荡培养16小时。完成培养后离心培养液，收集细胞悬浮于0.5ml 20mMTris-HCl缓冲液(pH7.9)中，经超声处理破碎细胞离心分成两个部分：作为上清液的大肠杆菌细胞提取物和沉淀。对提取物和沉淀进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳并用考马斯亮蓝染色

    结果，对于大肠杆菌JM109/pTAC2检测不到神经酰胺糖内切酶激活物II另一方面，在大肠杆菌BL21(DE3)/pEAC001、大腸杆菌BL21(DE3)/pEAC101和大肠杆菌BL21(DE3)/pEAC201的提取物和沉淀中以及大肠杆菌BL21(DE3)/pEAC002的沉淀中则检测到由神经酰胺糖内切酶激活物II形成的带；由此证实了神经酰胺糖内切酶激活物II的表达。大肠杆菌BL21(DE3)/pEAC001在可溶性部分中产生高浓度的神经酰胺糖内切酶激活物II另外，大肠杆菌BL2(DE3)/pEAC201表达产物提供的带的位置几乎与红球菌菌种M-777产生之天然神经酰胺糖内切酶激活物II的带位置相同

    将大肠杆菌BL21(DE3)/pEAC101接种到5ml含100μg/ml氨苄青霉素的L培养基中，37℃振荡培养16小时；进一步将0.6ml培養液接种到300ml相同的培养基中并在37℃下振荡培养。当培养液浓度(660nm吸光率)达到大约0.5时加入IPTG至终浓度为1mM，然后在37℃下振荡培养过夜

    经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分析揭示了相当于分子量约28,000的单一带。使用BCATM蛋白质检测试剂(由Pierce生产)进行定量测定表明蛋白质含量为11μg/μl(转变为牛血清白疍白)。

    对本领域技术人员而言对本发明上述实施方案的其它修改显然包括在下文权利要求书限定的范围内。