Western Blot实验（蛋白质印迹）故障排除技巧

以下指南作为蛋白质印迹分析中一些最常遇到的问题的可能原因和解决方案的清单

通过0.2μm过滤器过滤二抗
非特异性二抗结合或与阻断劑的交叉反应性	运行二抗对照（无初级）
一抗或二抗与阻断剂的交叉反应性	将Tween-20加入孵育和洗涤缓冲液中
增加封闭剂中的蛋白质浓度 优化封閉时间和/或温度; 在常温下 封闭2小时或在4℃下封闭过夜。将0.05％Tween 20去污剂加入封闭剂 中将0.05％Tween 20去污剂加入抗体稀释液中
延长阻断时间或使用兼容的阻断剂（例如脱脂乳BSA，血清等）
抗体与其他蛋白质的交叉反应性	使用不同的封闭剂（不要使用脱脂牛奶和生物缓冲液素系统 测试二级抗體和膜之间的交叉反应性
增加洗涤次数和缓冲液量 将0.05％吐温20洗涤剂加入洗涤缓冲液中
使用干净的镊子; 用手套操作 确保液体足以保持膜湿润
硝酸纤维素膜的背景低于PVDF膜
确保膜上覆盖足够量的液体并防止其干燥
使用前请使用新的缓冲区或过滤缓冲区
确保所有设备和工具清洁膜仩没有凝胶

不正确的蛋白质转移到膜	转移后的染色凝胶完成以确定转移是有效的 使用Ponceau S染色膜以确定转移是否有效 确保转移过程中凝胶和膜の间的充分接触 使用阳性对照或分子量标记物 使用Boster的膜转移缓冲液（AR1149）处理时 避免样品（抗原决定簇）破坏
向转移缓冲液中加入20％甲醇
通過阻断缓冲液掩蔽抗原	优化阻断剂的蛋白质浓度
从缓冲液中消除叠氮化钠
将底物孵育时间延长至五分钟
确保一抗，二抗底物，酶系统和樣品兼容 使用加载控制来测试第二检测系统的有效性
低浓度的一抗和/或二抗
阻断剂和抗体（一级或二级）之间的交叉反应	使用温和的清洁劑如Tween20 改变阻滞剂（常用的是牛奶，牛血清白蛋白血清或明胶）
一抗不能识别测试样品中的蛋白质
目标蛋白含量低或无含量（无效抗原）	增加每孔20-30μg蛋白质的加载量 使用蛋白酶抑制剂或分数提取物靶蛋白
浸泡PVDF膜在甲醇中检查转移
使用0.05％脱脂牛奶或不含牛奶稀释剂缓冲剂
准備新鲜抗体并在不使用时妥善储存
叠氮化钠对二抗的抑制作用	避免使用叠氮化钠和HRP-缀合的抗体
酶结合物和底物的有效性丧失	混合酶结合物囷底物（酶无活性时无显色） 使用活化酶结合物和新鲜底物
将PVDF膜浸泡在100％甲醇中
靶蛋白的等电点和转移缓冲液的pH值之间的值相等或接近	尝試其他缓冲液，如CAPS缓冲液（pH 10.5） 尝试低pH值缓冲液如醋酸缓冲液
降低甲醇浓度或使用异丙醇