我想做定点突变，请各位高手帮帮忙(定点突变,载体,目的基因,载体连接) - DNA技术 - 生物秀
标题: 我想做定点突变，请各位高手帮帮忙(定点突变,载体,目的基因,载体连接)
摘要: [我想做定点突变，请各位高手帮帮忙(定点突变,载体,目的基因,载体连接)] 我的目的基因已经在载体上了，我可不可以直接通过PCR使得在载体上的基因实现定点突变，而无需先酶切后在PCR，再和载体连接！急盼复，谢谢！！！！ 关键词:[定点突变 载体 目的基因 载体连接 酶切 基因]……
我的目的基因已经在载体上了，我可不可以直接通过PCR使得在载体上的基因实现定点突变，而无需先酶切后在PCR，再和载体连接！急盼复，谢谢！！！！
回复你可以采用重叠延伸发产生定点突变，具体方法可见分子克隆（3rd)。回复我想使用试剂盒，可能会快些，看到网上的朋友提到TAKARA的试剂盒，但不知可否用于我说的那种突变！回复你可以直接通过PCR使得在载体上的基因实现定点突变，而无需先酶切后在PCR，再和载体连接,Takara的试剂盒要看你的目的基因的大小，太大的话，好象效果不太好，为什么不用重叠延伸PCR呢，又快又简单。回复建议参考使用 “大引物PCR法” 构建突变体。较为简单实用，花费少，只需3步PCR反应。我用此方法构建了4个突变体，总共耗时2周左右（包括测序）。国内夏家辉实验室也有相关文献报道：张铭湘等，一种简便快速构建基因突变体的方法。中华医学遗传学杂志，5-147。供参考。回复我的目的基因已经在载体上了，我可不可以直接通过PCR使得在载体上的基因实现定点突变，而无需先酶切后在PCR，再和载体连接！急盼复，谢谢！！！！完全可以，请看介绍。原理图：其原理是利用导入变异点的引物进行PCR反应后，对PCR产物进行末端平滑及5"磷酸(P)化处理，再用高效连接试剂Ligation Solution I 进行自身连接（环化反应)，然后转化、克隆、提取变异体DNA。Protocol
PCR反应 设计合成高特异性的变异导入Primer和对应PCR用Primer。对应PCR用Primer的5"碱基的互补碱基必须和变异导入Primer的5"碱基相邻接（见原理图)。 调制以下组成的PCR反应液(Total 50 μl) 10×Pyrobest Buffer 5 μl dNTP Mixture (各2.5 mM) 4 μl Primer 1 0.2～1.0 μM (final conc.) Primer 2 0.2～1.0 μM (final conc.) Template 1～10 ng Pyrobest DNA Polymerase (5 U/μl) 0.25 μl 灭菌蒸馏水 up to 50 μl 按下列反应条件进行PCR反应。 对PCR反应液进行1% Agarose凝胶电泳。 切胶回收目的DNA片段。
Blunting Kination反应 在微量离心管内制备下列反应液 DNA Fragment 0.2～20 pmol 10×Blunting Kination Buffer 2 μl Blunting Kination Enzyme Mix 1 μl ddH2O up to 20 μl 37℃反应10分钟。 把反应溶液用ddH2O稀释至100 μl，加入等量的苯酚／氯仿溶液。 剧烈振荡均匀，用微型离心机离心1分钟，液体分为二层。小心取出水相（上层）移到另一个新的微量离心管中。 重复操作3.～4.。 向水相溶液中加入等体积的氯仿，充分混匀后离心数秒钟。小心取出水相（上层）移到另一个新的微量离心管中。 向水相溶液中 加入1/20体积的3 M NaCl, 然后再加入2.5倍体积的乙醇, 混匀后在-20℃下放置30分钟。 用微型离心机离心10分钟，除去上清液。 沉淀用70%乙醇清洗2次，除去乙醇后，沉淀真空干燥。 用20 μl TE Buffer溶解沉淀。 　
Ligation反应取5 μl上记10.的溶液于新的微量离心管中。 加入等量的Ligation Solution I，均匀混合后16℃反应1小时。 全量反应液用于转化100 μl的感受态细胞。 * 用电刺激法转化时，先用乙醇沉淀等方法置换连接液后再进行转化。回复还是野原建议的“大引物PCR”经济实用，imsupergene所说的其实是Takara的定点突变试剂盒的Protocol。当然如果你的Money足够多，可以买来作；如果想节省一点嘛，强烈建议使用大引物PCR法。我去年也曾用此方法构建的3个Mutant，理论上讲，只要Taq酶保真性好，用此种方法构建成功率是100％。大引物PCR法在分子克隆第3版上有详细介绍，国内也有相关文献报道，如湘雅医院的夏家辉等。简单讲，原理是设计3条引物：1条突变引物（将欲突变的位点放置于引物中间位置），另2条引物位于突变引物的两侧，并带上合适的酶切位点，以供突变片断构建完成后可以克隆入合适的载体。然后以突变引物和2条引物中相邻较近的反向引物一起扩增带突变位点的片断；再以次PCR产物片断为引物与剩下的另一条引物一起扩增，扩增出的片断因为带有合适的酶切位点就可以克隆入合适的载体。此种方法的优点在于（1）可以利用PCR产物作为引物来扩增突变片段从而把突变位点引入。（2）可以不需要用特定的质粒作为模板（3）由于可以加上合适的酶切位点，又适合于使之克隆进入与原来模板不同的载体。（4）另外，该方法不需订购任何特殊试剂，稍微好一点的Taq就搞定。
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[求助]形体训练用什么音乐？什么训练课程？各位高手帮帮忙吧！
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本帖最后由 舞空舞色 于
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[求助]我是一名中学音乐老师，以前没有正规学习，但是我很爱舞蹈，也曾经参加大市比赛，获得过一等奖。但是我只会跟着老师学跳。现在，学校安排我上舞蹈课，发愁，怎么上啊？用什么音乐啊？什么训练课程啊？各位专家能不能不指点一下啊！万分感谢！
该用户从未签到
本帖最后由 舞空舞色 于
05:00 编辑
&p&如果就只是简单的形体训练,我建议你找一些例如天鹅湖之类的耳熟能详的钢琴曲,内容嘛!我想你是给中学生上吧,中学生长时间坐在教室学习,所以要根据学生的身体条件编排一些练习组合.比如说在地面上纠正学生的坐姿,就可以将头部,颈部,肩部,腕部,做个活动练习;然后在把上纠正学生的站姿,后背的挺拔等;再然后就是在中间进行一些锻炼上肢和下肢协调性的小组合,可以加入一些民间舞的内容!安排一些群舞的排练,激发学生的合作精神!&/p&&p&除此之外,给学生看一些舞蹈资料,我是指电教,提高学生的欣赏和审美能力.也就是说在教书过后进入到育人的阶段!&/p&&p&说的不全面,希望高手们补充!&/p&
签到天数: 1 天连续签到: 0 天[LV.1]初来乍到
&&& 我认为你选一些钢琴曲(旋律不能太复杂,否则基础差的难以掌握)和民歌民曲及一些古曲,这样教起来,不管是芭蕾,古典舞,民族民间舞等基本上够用的了.仅供参考.
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&p&谢谢两位了！&/p&
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还请高手多多指教啊！
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&p&&对于简单的形体训练，选用一些乐句很工整的钢琴曲会很好！&/p&
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&p&辽宁省考级教材&/p&&p&&/p&
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&p&谢谢！能提供更详细的信息吗？如果那样就更好了！&/p&
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速度适合你的训练内容就可以用拉,这是我个人的认为
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Inc. & All Rights Reserved.各位高手帮帮忙，急啊！
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各位高手帮帮忙，急啊！
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